【預期用途】

僅供科研使用，本試劑盒用于測定人血清、血漿及相關(guān)液體樣本中腸病毒(Enterovirus)表達。

【檢測原理】

本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測定標本中人腸病毒(Enterovirus)表達。用純化的人腸病毒(Enterovirus)抗體包被微孔板，制成固相抗體，可與樣品中腸病毒(Enterovirus)相結(jié)合，經(jīng)洗滌除去未結(jié)合的抗原和其他成分后再與HRP標記的腸病毒(Enterovirus)抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，經(jīng)過*洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），與CUTOFF值相比較，從而判定標本中人腸病毒(Enterovirus)的存在與否。

注意：使用前請檢查試劑盒中試劑的標簽和數(shù)量與表格是否一致。

需要但未提供的材料及耗材

1、酶標儀（建議儀器使用前提前預熱）

2、精密移液器、吸頭、加樣槽

3、蒸餾水或去離子水

4、洗瓶或者自動洗板機

5、37℃水浴鍋或恒溫箱

6、EP管

7、無粉一次性乳膠手套

【儲存條件及有效期】

  1、2-8℃保存，切勿冷凍，有效期6個月。

  2、開封使用后，包被微孔板放入帶有干燥劑的自封袋中，密閉自封袋，并將全部試劑放回2-8℃冰箱。

注意：試劑盒內(nèi)酶標條可拆卸，按實驗需求可分多次使用；使用后的剩余試劑盒建議在第一次實驗后1 個月內(nèi)使用完畢。產(chǎn)品過期時間以盒子上的標簽為準，保質(zhì)期內(nèi)所有組分都確保是穩(wěn)定的。

【適用儀器】

  半自動的酶標儀，如Thermo MK3，或者國產(chǎn)酶標儀。

【操作步驟】

1.標準品的稀釋：本試劑盒提供原倍標準品一支，用戶可按照下列圖表在小試管中進行稀釋。

2.加樣：分別設(shè)空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、標準孔、待測樣品孔。在酶標包被板上標準品準確加樣50μl，待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品10μl（樣品最終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。

3.溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。   

4.配液：將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用。

5.洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復5次，拍干。

6.加酶：每孔加入酶標試劑50μl，空白孔除外。

7.溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。

8.洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復5次，拍干。

9.顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色10-20分鐘。

10.終止：每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）。

11.測定：以空白孔調(diào)零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。測定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進行。

注意：

1.試劑準備：試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡15-30分鐘后方可使用。準備一次實驗所需要的酶標條，其它的可從微孔板上拆下，密封，按照說明書要求保存，以備下次使用。

2.加樣：實驗操作中請使用一次性的滅菌吸頭，避免污染。加樣時注意不要有氣泡產(chǎn)生，將樣品加于酶標板底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。與反應(yīng)試劑加入一樣，加樣過程中第一個孔與最后一個孔加樣時間間隔盡量小（一般控制在10 分鐘以內(nèi)），如果太大，將會導致不同的“預溫育"時間，從而明顯地影響到測量值的準確性及重復性。為了測值的準確性，推薦設(shè)置復孔進行實驗。

3.溫育：為防止樣品蒸發(fā)，實驗時請將加上蓋或覆膜的酶標板置于濕盒內(nèi)，以避免液體蒸發(fā)，洗板后應(yīng)盡快進行下步操作，任何時侯都應(yīng)避免酶標板處于干燥狀態(tài)，同時應(yīng)嚴格遵守給定的溫育時間和溫度。

4.洗滌：濃洗滌液可能會有結(jié)晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結(jié)果。充分洗滌非常重要，在每次洗滌過程中，都要將洗滌液*甩干。洗滌過程中反應(yīng)孔內(nèi)殘留的洗滌液應(yīng)在吸水紙上拍干，勿將吸水紙直接放入反應(yīng)孔中吸水，同時要輕輕擦除板底殘留的液體和手指印，避免影響最后的酶標儀讀數(shù)。如果使用自動洗板機，請在熟練使用后再用于正式實驗過程中。

5.反應(yīng)時間的控制：加入底物后請定時觀察反應(yīng)孔的顏色變化，如觀察到顏色較深，請?zhí)崆凹尤虢K止液終止反應(yīng)，避免反應(yīng)過強而影響酶標儀光密度讀數(shù)。

6.底物：底物請避光保存，在儲存和溫育時避免強光直接照射。