酸性磷酸酶的顯示方法

1.目的與原理
實驗目的：
　　掌握Comori法的基本原理和方法。觀察酸性磷酸酶在細胞內的分布狀況。

實驗原理：
　　酸性磷酸酶能分解磷酸脂而釋放出磷酸基。在pH5．0的環(huán)境中，磷酸基能與鉛鹽反應形成磷酸鉛。但因其是無色的，所以再經過與硫化銨作用，形成棕黑色的硫化鉛沉淀，由此就能顯示酸性磷酸酶在細胞內的存在與分布。

本實驗的技術特點是：
（1）采用冷凍涂片和中性福爾馬林固定，可避免在固定、包埋及制片過程中酶的失活，保證了實驗的穩(wěn)定性。

（2）采用較短的作用時間，可避免細胞質內其它蛋白質及核內出現(xiàn)陽性假象，保證了實驗的可靠性。

（3）以姬姆薩淡染的巨噬細胞為觀察對象，細胞核及細胞輪廓以及細胞質中反應沉淀的顆粒都比較清晰，有助于深入理解細胞吞噬作用、溶酶體功能和分布以及溶酶體標志酶——酸性磷酸酶的性質等理論問題。

2.實驗用品
材料：
小鼠腹腔液涂片（重點觀察巨噬細胞）。

試劑：
（1）．10％中性福爾馬林（pH6．8～7．1）甲醛 10ml 蒸餾水 90ml 醋酸鈉 2g
（2）．酸性磷酸酶作用液
　　 蒸餾水 90ml 0．2mol／L醋酸緩沖液（pH4．6） 12ml 5％* 2ml
（3）．2％β—甘油磷酸鈉 4ml
　　 先將蒸餾水和醋酸緩沖液混合，隨后分成大致相等的兩份，一份中加*溶液，另一份加甘油磷酸鈉溶液，然后再將兩者緩緩混合，邊混邊攪勻后若酸堿度值不到pH5．0，可加少量醋酸的調整。此作用液在臨用前配制，不能貯存。配好后的作用液應透明無絮狀懸浮物和沉淀，否則將嚴重影響實驗結果。

（4）．1％硫化胺溶液
　　 硫化胺 1ml 蒸餾水 9ml

（5）．姬姆薩染液（1：30）
　　姬姆薩原液 3滴 磷酸鹽緩沖液（pH6．8） 5ml

（6）．6％淀粉肉湯
　　牛肉膏 0．3g 蛋白胨 1.0g 氯化鈉 0．5g 蒸餾水 100ml
　　高壓滅菌9．9×104pa（15磅）20min，再加入可溶性淀粉6g，水溫浴，促使溶解后置冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

3.實驗方法

（1）．取小白鼠一只，每日腹腔注射6％淀粉肉湯1ml，連續(xù)注射三天。
（2）. 在第三天注射后3～4h，再向腹腔注射生理鹽水1ml，過3min后在原注射部位抽取腹腔液0．1～0．2ml。請注意!注射和抽液的進針部位和深度要保持一致。否則可能抽不出腹腔液。

（3）．將腹腔液滴在預冷的載玻片上，每片1～2滴，涂片，將玻片垂直插入玻片架，迅速放到冰箱內（4℃），讓細胞自行鋪展。

（4）．30min后，將玻片轉入10％中性福爾馬林，冰箱內4℃固定30min。

（5）．自來水漂洗5min，把水甩干。

（6）．轉入酸性磷酸酶作用液中，37℃處理30min。

（7）．自來水漂洗片刻。

（8）．1％硫化胺處理3～5min。

（9）. 自來水沖洗，甩干。

（10）. 用1∶30的姬姆薩染液染色15min。

（11）．自來水沖去染液，用磷酸鹽緩沖液臨時封片，鏡檢。

（12）．對照實驗：

　　將第3步的腹腔液涂片置50℃溫箱中處理30min，使酶失活，再進行6～11步的同樣實驗。

4.實驗結果

　　巨噬細胞的細胞質中，出現(xiàn)許多棕色或棕黑色的顆粒和斑塊。部分細胞內，酸性磷酸酶極為豐富。整個細胞質區(qū)域都有黑色沉淀。中性粒細胞呈現(xiàn)陰性反應。