一、實驗目的

1、深入了解ELISA 法測定抗體效價的原理。

2、掌握ELISA 法測定單克隆抗體效價的方法。

二、實驗原理

ELISA 是以免疫學反應為基礎，將抗原、抗體的特異性反應與酶對底物的高效催化作用相結合起來的一種敏感性很高的試驗技術。免疫酶技術是將酶標記在抗體/抗原分子上，形成酶標抗體/酶標抗原，稱為酶結合物。該酶結合物的酶在免疫反應后，作用于底物使之呈色，根據(jù)顏色的有無和深淺，定位或定量抗原/抗體。ELISA 法是免疫酶技術的一種，其特點是利用聚苯乙烯微量反應板(或球)吸附抗原/抗體，使之固相化，免疫反應和酶促反應都在其中進行。在每次反應后都要反復洗滌，這既保證了反應的定量關系，也避免了末反應的游離抗體/抗原的分離步驟。在ELISA 法中。酶促反應只進行一次，而抗原、抗體的免疫反應可進行一次或數(shù)次，即可用二抗(抗抗體)、三抗再次進行免疫反應。

目前常用的幾種ELISA 方法有：測定抗體的間接法，測定抗原的雙抗體夾心法和測定抗原的競爭法等。本實驗采用間接法測定單克隆抗體效價。其主要過程為：首先將已知定量抗原吸附在聚苯乙烯微量反應板的凹孔內(nèi)，加待測抗體，保溫后洗滌以除去未結合的雜蛋白質(zhì)，加酶標抗抗體，保溫后洗滌，加底物保溫30分鐘后，加酸或堿終止酶促反應，用目測或光電比色測定抗體含量。

三、儀器、原料和試劑

儀器

聚苯乙烯96孔酶標板、微量移液管、酶聯(lián)免疫閱讀儀、水浴鍋。

原料

單克隆抗體

試劑

1、 抗原及酶標記抗體

①抗原：兔抗人IgG(Rabbit Aanti-human IgG，Code No．A0423)；

②酶標抗抗體：兔抗鼠IgG-HRP(Rabbit Anti-mouse IgG-HRP，Code No．P0260)；均為DAKO 公司產(chǎn)品，使用時按照說明書要求稀釋。

4、 洗滌液(含0.05％Tween 20的PBS)：1LPBS 中加入Tween-20 500μL.

5、 封閉液(含1％牛血清白蛋白，0.1％Tween 20的PBS)：10mLPBS 中加入100mgBSA，10μLTween-20.

6、 底物溶液

①ling酸鈉鹽緩沖液(0.1mol/LpH6.0)：稱Na2HPO4·12H2O2.2g，NaH2PO4·2H2O 6.84g，用蒸餾水溶解，定容至500mL.

② TMB 貯液：稱60mgTMB 溶于10mL 二甲基亞砜中，4℃避光保存。

③底物應用液：現(xiàn)用現(xiàn)配，磷酸鈉緩沖液10mL，TNB 貯液10μL.30％H2O2 15μL，混勻。

7、 終止液：2mol/LH2SO4

四、操作步驟

①抗原包被：兔抗人IgG 作為抗原，用包被液l：8000稀釋，100μL/孔加入聚苯乙烯96孔反應板中。4℃放置過夜。

②洗滌：次日傾去凹孔內(nèi)的液體，洗滌液洗3次。

③封閉：加l00μL/孔封閉液，室溫放置0.5h.

④洗滌：用洗滌液洗3次。

⑤加待測樣品(一抗)：將含單克降抗體的細胞培養(yǎng)上清在另-塊板上用PBS 連續(xù)稀釋(按照1：2或1：10)，100μL /孔加到已包被的板上，每個樣品平行做兩份，PBS 或空白培養(yǎng)基作為陰性對照，已知樣品作為陽性對照。加蓋37℃恒溫箱溫育1~2h.

⑥洗滌：用洗滌液洗3次。

⑦加酶標抗抗體：兔抗鼠IgG-HRP，用封閉液l ：8000稀釋，100μL／孔，加蓋37℃恒溫箱溫育1h。

⑧洗滌：用洗滌液洗5次，蒸餾水洗2次。

⑨顯色：加新鮮配制的底物溶液100μL/孔，室溫暗處放置5～30min，顯示藍色。

⑩終止反應、比色：加50μL/孔終止液。顏色變黃；用酶標儀測定450nm 處各孔的吸光值，陽性反應的最大稀釋度為待測樣品的效價。