上海“勁馬”蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定

一、實(shí)驗(yàn)原理

蛋白質(zhì)在十二烷基硫酸鈉（SDS）和巰基乙醇的作用下，分子中的二硫鍵還原，氫鍵等打開(kāi)，形成按1.4gSDS/1g蛋白質(zhì)比例的SDS-蛋白質(zhì)多肽復(fù)合物，該復(fù)合物帶負(fù)電，故可在聚丙烯酰胺凝膠電泳中向正極遷移，且主要由于凝膠的分子篩作用，遷移速率與蛋白質(zhì)的分子量大小有關(guān)，因此可以濃縮和分離蛋白質(zhì)多肽。

聚丙烯酰凝膠電泳分離蛋白質(zhì)多數(shù)采用一種不連續(xù)的緩沖系統(tǒng)，主要分為較低濃度的成層膠和較高濃度的分離膠，配制凝膠的緩沖液，其pH值和離子強(qiáng)度也相應(yīng)不同，故電泳時(shí)，樣品中的SDS-多肽復(fù)合物沿移動(dòng)的界面移動(dòng)，在分離膠表面形成了一個(gè)極薄的層面，大大濃縮了樣品的體積，即SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的濃縮效應(yīng)。

二、儀器及器材

垂直電泳槽及附件、直流穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀、移液器等。

上海勁馬實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司代理的產(chǎn)品以?xún)?yōu)異的質(zhì)量，熱情的服務(wù)，贏得廣大新老顧客的信任。

本公司主營(yíng)銷(xiāo)售：ELISA試劑盒，進(jìn)口胎牛血清，進(jìn)口抗體，生物試劑等多種產(chǎn)品，更多產(chǎn)品詳情歡迎您。

三、試劑

1、凝膠貯備液：稱(chēng)取30g 丙烯酰胺（Acr）和0.8g 甲叉-雙丙烯酰胺（Bis），蒸餾水溶解后定容至100mL，濾紙過(guò)濾貯存。

2、10% SDS：稱(chēng)取SDS 10g 加蒸餾水至100ml。

3、10%過(guò)硫酸胺（AP），用時(shí)現(xiàn)配。

4、N，N，N’，N’四甲基乙二胺（TEMED）。

5、電極緩沖液：3.03g Tris、14.14g甘氨酸、1.0g SDS溶于水，混勻后用HCL調(diào)節(jié)pH至8.3，加蒸餾水至1 000ml。

6、樣品溶解（緩沖）液：0.6gTris、5mL甘油（丙三醇）1.0g SDS溶于水，混勻后用HCL調(diào)節(jié)pH至8.0，再加0.1g溴酚藍(lán)、2.5mL巰基乙醇，定容至100mL。

7、下層膠（分離膠）緩沖液：18.17g Tris、0.4gSDS溶于水，混勻后用1mol/L HCL調(diào)節(jié)pH至8.8，加蒸餾水至100ml。

8、上層膠（濃縮膠）緩沖液：6.06g Tris、0.4gSDS溶于水，混勻后用1mol/L HCL調(diào)節(jié)pH至6.8，加蒸餾水至100ml。

9、固定液：25%異丙醇，10%乙酸。

10、染色液：0.125g考馬斯亮藍(lán)R-250加固定液250ml。

11、脫色液：冰乙酸75ml、甲醇50ml，加水定容至1000ml。

12、1.5%瓊脂：1.5g瓊脂溶于100mL電極緩沖液中，加熱溶解。

13、標(biāo)準(zhǔn)相對(duì)分子質(zhì)量蛋白質(zhì)。

四、操作步驟

1、電泳槽的安裝

干燥的兩塊玻璃板裝入配套塑料夾套內(nèi)，垂直固定在電泳槽上，周邊用1.5%的瓊脂密封。

2、樣品的制備

稱(chēng)取1g待測(cè)植物鮮樣置于冰浴上的研缽內(nèi)，加入1mL去離子水研磨成勻漿，轉(zhuǎn)入離心管中，再加入2mL去離子水沖洗研缽，3500r/min離心20min，上清液備用。

將標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)和待測(cè)樣品分別溶于樣品溶解液，在沸水中加熱3-4min，待冷卻后作點(diǎn)樣用。

3、制膠

選擇合適的膠濃度（表1），配制分離膠，混合后將其沿長(zhǎng)玻璃板加入兩塊玻璃板之間（小心不要產(chǎn)生氣泡），加到距短玻璃板上邊緣3cm處，立即覆蓋2-3mm水層，靜止聚合約40min左右。膠聚合好的標(biāo)志是膠與水之間形成清晰的界面。

吸取分離膠的水分，將配好的濃縮膠（表1）注入分離膠之上，立即插上有機(jī)玻璃的點(diǎn)樣槽模板，待濃縮膠聚合好備用。

表1 不同濃度凝膠體系

4、點(diǎn)樣

用移液器分別吸取標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)5μL和樣品液20μL，注入樣品槽內(nèi)的濃縮膠上面，同時(shí)在樣品上小心地注入電極緩沖液。

5、電泳

加樣完畢，電泳槽內(nèi)注入適量電極緩沖液，接通電源（上負(fù)下正），調(diào)節(jié)電流為15mA，當(dāng)指示劑進(jìn)入分離膠后，電流需加大到30mA，電壓恒定在80-100V，約3-4h后，指示劑達(dá)到距離前沿1-2cm時(shí)，可終止電泳。

6、固定

膠取出后，在水中浸泡10min，浸出部分SDS，然后將膠浸泡在25%異丙醇和10%乙酸的混合液中1h，蛋白質(zhì)就會(huì)到固定。

7、染色

取出凝膠板，加入染色液染色2h。

8、脫色

將膠放在脫色液中脫色0.5h，每隔0.5h換一次脫色液，至少換3次，待藍(lán)色基本脫掉，再放在脫色液里浸泡至蛋白質(zhì)譜帶清晰為止。

9、照相。

 公司名稱(chēng)：上海勁馬實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司

地址:上海市閔行區(qū)莘莊工業(yè)園區(qū)金都路3688號(hào)E幢101-106室
：201100 
：86- 
手機(jī): ， 
: 何 
86－ 
： 
: shjmswkj@