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15種蛋白質單晶培養(yǎng)的方法
更新時間：2009-11-23 瀏覽次數：3496
要培養(yǎng)蛋白質單晶，必須在蛋白質溶液，添加鹽類和沈淀劑，調整pH值和溫度，再將部份水分蒸發(fā)，使蛋白質溶液達過飽和，緩慢沈積，產生晶核（nucleation），慢慢長成夠大的單晶。X光源的強弱限制單晶的大?。簩ν捷椛涔庠炊?，0.1 mm的單晶就夠作X光繞射實驗；轉靶式X光則用0.3 mm以上的單晶尺寸;封管式的X光得用0.4 mm以上的單晶較合適。有時候單晶含重原子也可犧牲尺寸。以上所列的尺寸只供較佳范圍的參考，特例不能*排除。
（1）大量養(yǎng)晶法（bulk crystallization）：若急著養(yǎng)出單晶，則將純化之蛋白質溶液加入固體鹽類或飽和鹽液，直到溶液中出現乳白混濁色，離心后把上清液（suppernatant）放置數天至數周，有可能養(yǎng)出單晶。
（2）批次養(yǎng)晶法（batch method）:若發(fā)現加入蛋白質的沉淀劑和鹽類等化學藥品，在濃度C1產生沉淀，濃度Cn為液體，則在C1至Cn之間細分成一串濃度C1>C2>C3>….>Ci>Cn，（n-2）個小試管進行養(yǎng)晶，可能結出單晶。此法之主要缺點在于蛋白質的消耗量大。
（3）大量透析法（bulk dialysis）：把蛋白質溶液包在半透膜（membrane）內，浸入盛有化學藥品的器皿中，半透膜能讓小分子進出，卻不會讓蛋白質等大分子通過，則器皿中沉淀劑、鹽類和有機溶液等化學藥品會穿過半透膜，與蛋白質起作用，直到膜之內外的濃度梯度（concentration gradient）降到零為止。此法的好處在于，器皿中化學藥品之濃度可作連續(xù)之調整，pH值的范圍也可探討。壞處是膜之內外濃度差異減少時，平衡速率也隨之降低。
（4）微量透析法（microdialysis）:把半透膜的體積縮小，綁在比鈕扣略大的襯架上，架體之凹槽內注入蛋白質溶液，包覆半透膜的體架放入盛有化學藥品的器皿，其養(yǎng)晶原理與大量透析法相同，只是使用蛋白質和化學藥品的量放得少。注意凹槽內不得留有氣泡，否則膜外的化學藥品為氣泡所阻止而無法透過氣泡，滲入膜內的蛋白質溶液。
（5）連續(xù)萃?。╯equential extraction）：此法所根據的原理是亞可比（Jacoby）的實驗，他發(fā)現蛋白質在硫酸銨溶液中溶解度隨溫度的提升而下降。在4℃以下取得上清液（supernatant），放在室溫長晶。先將蛋白質溶液加入固體硫酸銨或飽和硫酸銨液體，使蛋白質溶液沉淀，離心除去上清液。接著保持4℃以下處理一系列的蛋白質沉淀物。準備數種依次遞降濃度的沉淀劑（通常為蒸餾水），濃度高的沉淀劑先加入上述蛋白質沉淀物中，以玻棒攪拌并離心，取出上清液，放在室溫養(yǎng)晶，再把濃度次高的沉淀劑加入上次未*溶解的蛋白質沉淀物，攪拌離心，把上清液置于室溫養(yǎng)晶，依次類推，直到蛋白質全部溶解為止。這樣每次取出的蛋白質濃度依次遞減，溶液由低溫移至高溫，符合亞可比的準則，可能養(yǎng)出蛋白質單晶。
（6）自由接口間的擴散法（free interface diffusion）：若蛋白質在不同的溶劑中具有不同的溶解度，則蛋白質注入盛有沉淀劑試管的上方或下方（依密度而定，密度大者放在下方），在兩種溶液的交界面擴散會有晶核長出，裝置如圖7-10所示。
（7）凹盤或玻片上的蒸汽擴散法（vapor diffusion on plates or slides）—座滴法：蛋白質養(yǎng)晶的要領在于蛋白質達成過飽和溶液，同時添加的化學藥物與蛋白質起作用，協助晶核的形成。摻有化學藥品的蛋白質溶液，其水分慢慢擴散，達到過飽和溶液則有可能長出單晶。若蛋白質溶液暴露在空氣中，水分蒸發(fā)掉，則蛋白質干涸，無法形成單晶，原因是蛋白質單晶約略維持液態(tài)的結構，含有大量水分，水分與蛋白質間形成許多氫鍵，水分蒸發(fā)，蛋白質也無以為系，因此必須保持水分，使蛋白質溶液密閉在一個容器中。同時還得調節(jié)水分，所以必須置放兩種溶液，使蛋白質溶液中的水分擴散到另一種高濃度的溶液中，以達蛋白質溶液的過飽和。通常選擇適當的鹽類和有機溶劑，調在等電點的pH值，形成沉淀劑，把粉晶蛋白質泡成一定濃度，約在5～40mg/ml之間，在凹盤的下凹孔鍍硅，注入一些蛋白質溶液和沉淀劑總共10～40 m l。在凹盤外方的塑料盒，倒入20～30ml的沉淀劑。在塑料的四周涂真空油膏（Vacuum grease），加以密封。通常這樣的塑料盒對于每種養(yǎng)晶條件制備兩盒，一盒放在4℃的低溫，另盒放在室溫，待其長晶，快則一周，慢則數月，幸運的話，可望長出單晶。通常一次制備數拾條件，大量養(yǎng)晶。要鑒定長出的單晶確實是蛋白質而不是滴入的沉淀劑等化學藥品。若養(yǎng)出蛋白質單晶太小，不足以供X光繞射實驗使用，則可使用連續(xù)播種法把小晶粒養(yǎng)大：依照養(yǎng)出蛋白質小單晶的條件，炮制母液（蛋白質溶液配合沉淀劑），注入凹孔，外圍倒注沉淀劑，加以密封，等待約半天后，打開封蓋，把以前所養(yǎng)的小晶粒稍加清洗后放入，企圖長大，若長出的晶體仍然不符X光使用，則把zui后一次的晶體當新晶種，再繼續(xù)播種，直到晶體夠大。此種養(yǎng)晶法的好處是：用量少，篩選多種條件相當理想;易于修飾塑料盒內沉淀劑的濃度。此種養(yǎng)晶法裝置，也可用具有凹槽的玻片來取代，在其一凹孔注入10m l的母液，另一凹孔注入20～40m l的沉淀劑，以小玻片密封，等待長晶。
（8）懸滴液蒸汽擴散法（vapor diffusion in hanging drops）—懸滴法: 它在原理上和座滴法相同，皆以蒸汽達到平衡，利用少量蛋白質篩選多種養(yǎng)晶條件。此法用量比座滴液更少。在方形或圓形的玻片上鍍硅，滴入少于10m l的蛋白質母液，在培養(yǎng)皿的每一凹槽中注入1 ml的沉淀劑，把方形玻片翻轉，蓋在凹槽孔緣，加以密封，形成懸滴液，進行擴散，蛋白質溶液達到過飽和，長出單晶。
（9）液體橋連法（liquid bridge）如圖7-12（b）所示，一小滴母液和一滴沉淀液分別滴在玻璃片的兩靠近處，以細針引導細橋相接，把此載有液滴的玻片放在密封容器中，在細橋相連處可望長出單晶。（10）濃度透析法（concentration dialysis）：，離子強度弱，則蛋白質溶解度低，易形成晶核，長出單晶，可利用氮氣在裝有蛋白質和鹽類的透析袋內施壓，使鹽類穿透透析膜流出，降低袋內鹽類濃度，使蛋白質溶液在低離子強度下長出單晶。
（11）pH引導長晶法（crystallization induced by pH）：蛋白質的溶解度在等電點的pH值zui低，是個良好的養(yǎng)晶條件。有些蛋白質在不同的數個pH值，具有數個溶解度的極小，這些溶解度極小處可望長晶。利用透析法改變透析膜外的pH值是個好辦法。也可在蒸汽擴散法中，在外圍滴入揮發(fā)性酸或堿（如氨水或干冰等）來調節(jié)pH值。
（12）溫度長晶法（temperature crystallization）：蛋白質溶解度為溫度的函數，有些溶解度非常溫度敏感。通常溫度降低，分子排列較有秩序，引起能趨疲（熵）（entropy）的降低。由液體轉變到固體，其熵會降低，反之亦然。井然有序排列的分子易于長晶。通常一種長晶條件泡兩份，一份置于室溫，另一份放在4℃的冰箱。
（13）蒸發(fā)（evaporation）：這是zui原始的方法，為小分子的長晶常用法，也是某些蛋白質常用的養(yǎng)晶法。在蛋白質不變性的條件下，慢慢讓母液蒸發(fā)，使蛋白質溶液達到過飽和，結出單晶。
（14）填加有效分子法（effector addition）：與有效分子（effector）結合的蛋白質，其溶解度往往與無有效分子結合者差異大，可達到某些構象（conformation）平衡狀態(tài)的存在，養(yǎng)出此種構象單晶，通常的有效分子有配位體（ligand）和基質（substrate）等。
（15）對蒸餾水透析法（dialysis against water）：離子強度弱則蛋白質溶解度低，以半透膜裝母液，外浸蒸餾水，鹽類往膜外透出，待膜內蛋白質溶解度降低，可望長出單晶。此法相當有效，值得嘗試。前提是蛋白質不得變性（denature），有時添加少許 [0.02%（w/v）] 的 Sodium azide，或數滴甲苯（toluene）或氯仿（chloroform）有助防止細菌的滋長。
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（1）大量養(yǎng)晶法（bulk crystallization）：若急著養(yǎng)出單晶，則將純化之蛋白質溶液加入固體鹽類或飽和鹽液，直到溶液中出現乳白混濁色，離心后把上清液（suppernatant）放置數天至數周，有可能養(yǎng)出單晶。
（2）批次養(yǎng)晶法（batch method）:若發(fā)現加入蛋白質的沉淀劑和鹽類等化學藥品，在濃度C1產生沉淀，濃度Cn為液體，則在C1至Cn之間細分成一串濃度C1>C2>C3>….>Ci>Cn，（n-2）個小試管進行養(yǎng)晶，可能結出單晶。此法之主要缺點在于蛋白質的消耗量大。
（3）大量透析法（bulk dialysis）：把蛋白質溶液包在半透膜（membrane）內，浸入盛有化學藥品的器皿中，半透膜能讓小分子進出，卻不會讓蛋白質等大分子通過，則器皿中沉淀劑、鹽類和有機溶液等化學藥品會穿過半透膜，與蛋白質起作用，直到膜之內外的濃度梯度（concentration gradient）降到零為止。此法的好處在于，器皿中化學藥品之濃度可作連續(xù)之調整，pH值的范圍也可探討。壞處是膜之內外濃度差異減少時，平衡速率也隨之降低。
（4）微量透析法（microdialysis）:把半透膜的體積縮小，綁在比鈕扣略大的襯架上，架體之凹槽內注入蛋白質溶液，包覆半透膜的體架放入盛有化學藥品的器皿，其養(yǎng)晶原理與大量透析法相同，只是使用蛋白質和化學藥品的量放得少。注意凹槽內不得留有氣泡，否則膜外的化學藥品為氣泡所阻止而無法透過氣泡，滲入膜內的蛋白質溶液。
（5）連續(xù)萃?。╯equential extraction）：此法所根據的原理是亞可比（Jacoby）的實驗，他發(fā)現蛋白質在硫酸銨溶液中溶解度隨溫度的提升而下降。在4℃以下取得上清液（supernatant），放在室溫長晶。先將蛋白質溶液加入固體硫酸銨或飽和硫酸銨液體，使蛋白質溶液沉淀，離心除去上清液。接著保持4℃以下處理一系列的蛋白質沉淀物。準備數種依次遞降濃度的沉淀劑（通常為蒸餾水），濃度高的沉淀劑先加入上述蛋白質沉淀物中，以玻棒攪拌并離心，取出上清液，放在室溫養(yǎng)晶，再把濃度次高的沉淀劑加入上次未*溶解的蛋白質沉淀物，攪拌離心，把上清液置于室溫養(yǎng)晶，依次類推，直到蛋白質全部溶解為止。這樣每次取出的蛋白質濃度依次遞減，溶液由低溫移至高溫，符合亞可比的準則，可能養(yǎng)出蛋白質單晶。
（6）自由接口間的擴散法（free interface diffusion）：若蛋白質在不同的溶劑中具有不同的溶解度，則蛋白質注入盛有沉淀劑試管的上方或下方（依密度而定，密度大者放在下方），在兩種溶液的交界面擴散會有晶核長出，裝置如圖7-10所示。
（7）凹盤或玻片上的蒸汽擴散法（vapor diffusion on plates or slides）—座滴法：蛋白質養(yǎng)晶的要領在于蛋白質達成過飽和溶液，同時添加的化學藥物與蛋白質起作用，協助晶核的形成。摻有化學藥品的蛋白質溶液，其水分慢慢擴散，達到過飽和溶液則有可能長出單晶。若蛋白質溶液暴露在空氣中，水分蒸發(fā)掉，則蛋白質干涸，無法形成單晶，原因是蛋白質單晶約略維持液態(tài)的結構，含有大量水分，水分與蛋白質間形成許多氫鍵，水分蒸發(fā)，蛋白質也無以為系，因此必須保持水分，使蛋白質溶液密閉在一個容器中。同時還得調節(jié)水分，所以必須置放兩種溶液，使蛋白質溶液中的水分擴散到另一種高濃度的溶液中，以達蛋白質溶液的過飽和。通常選擇適當的鹽類和有機溶劑，調在等電點的pH值，形成沉淀劑，把粉晶蛋白質泡成一定濃度，約在5～40mg/ml之間，在凹盤的下凹孔鍍硅，注入一些蛋白質溶液和沉淀劑總共10～40 m l。在凹盤外方的塑料盒，倒入20～30ml的沉淀劑。在塑料的四周涂真空油膏（Vacuum grease），加以密封。通常這樣的塑料盒對于每種養(yǎng)晶條件制備兩盒，一盒放在4℃的低溫，另盒放在室溫，待其長晶，快則一周，慢則數月，幸運的話，可望長出單晶。通常一次制備數拾條件，大量養(yǎng)晶。要鑒定長出的單晶確實是蛋白質而不是滴入的沉淀劑等化學藥品。若養(yǎng)出蛋白質單晶太小，不足以供X光繞射實驗使用，則可使用連續(xù)播種法把小晶粒養(yǎng)大：依照養(yǎng)出蛋白質小單晶的條件，炮制母液（蛋白質溶液配合沉淀劑），注入凹孔，外圍倒注沉淀劑，加以密封，等待約半天后，打開封蓋，把以前所養(yǎng)的小晶粒稍加清洗后放入，企圖長大，若長出的晶體仍然不符X光使用，則把zui后一次的晶體當新晶種，再繼續(xù)播種，直到晶體夠大。此種養(yǎng)晶法的好處是：用量少，篩選多種條件相當理想;易于修飾塑料盒內沉淀劑的濃度。此種養(yǎng)晶法裝置，也可用具有凹槽的玻片來取代，在其一凹孔注入10m l的母液，另一凹孔注入20～40m l的沉淀劑，以小玻片密封，等待長晶。
（8）懸滴液蒸汽擴散法（vapor diffusion in hanging drops）—懸滴法: 它在原理上和座滴法相同，皆以蒸汽達到平衡，利用少量蛋白質篩選多種養(yǎng)晶條件。此法用量比座滴液更少。在方形或圓形的玻片上鍍硅，滴入少于10m l的蛋白質母液，在培養(yǎng)皿的每一凹槽中注入1 ml的沉淀劑，把方形玻片翻轉，蓋在凹槽孔緣，加以密封，形成懸滴液，進行擴散，蛋白質溶液達到過飽和，長出單晶。
（9）液體橋連法（liquid bridge）如圖7-12（b）所示，一小滴母液和一滴沉淀液分別滴在玻璃片的兩靠近處，以細針引導細橋相接，把此載有液滴的玻片放在密封容器中，在細橋相連處可望長出單晶。（10）濃度透析法（concentration dialysis）：，離子強度弱，則蛋白質溶解度低，易形成晶核，長出單晶，可利用氮氣在裝有蛋白質和鹽類的透析袋內施壓，使鹽類穿透透析膜流出，降低袋內鹽類濃度，使蛋白質溶液在低離子強度下長出單晶。
（11）pH引導長晶法（crystallization induced by pH）：蛋白質的溶解度在等電點的pH值zui低，是個良好的養(yǎng)晶條件。有些蛋白質在不同的數個pH值，具有數個溶解度的極小，這些溶解度極小處可望長晶。利用透析法改變透析膜外的pH值是個好辦法。也可在蒸汽擴散法中，在外圍滴入揮發(fā)性酸或堿（如氨水或干冰等）來調節(jié)pH值。
（12）溫度長晶法（temperature crystallization）：蛋白質溶解度為溫度的函數，有些溶解度非常溫度敏感。通常溫度降低，分子排列較有秩序，引起能趨疲（熵）（entropy）的降低。由液體轉變到固體，其熵會降低，反之亦然。井然有序排列的分子易于長晶。通常一種長晶條件泡兩份，一份置于室溫，另一份放在4℃的冰箱。
（13）蒸發(fā)（evaporation）：這是zui原始的方法，為小分子的長晶常用法，也是某些蛋白質常用的養(yǎng)晶法。在蛋白質不變性的條件下，慢慢讓母液蒸發(fā)，使蛋白質溶液達到過飽和，結出單晶。
（14）填加有效分子法（effector addition）：與有效分子（effector）結合的蛋白質，其溶解度往往與無有效分子結合者差異大，可達到某些構象（conformation）平衡狀態(tài)的存在，養(yǎng)出此種構象單晶，通常的有效分子有配位體（ligand）和基質（substrate）等。
（15）對蒸餾水透析法（dialysis against water）：離子強度弱則蛋白質溶解度低，以半透膜裝母液，外浸蒸餾水，鹽類往膜外透出，待膜內蛋白質溶解度降低，可望長出單晶。此法相當有效，值得嘗試。前提是蛋白質不得變性（denature），有時添加少許 [0.02%（w/v）] 的 Sodium azide，或數滴甲苯（toluene）或氯仿（chloroform）有助防止細菌的滋長。
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