熒光素標記抗體的方法——Marsshall 氏法

材料：

抗體球蛋白溶液、0.5mol/L、pH9.0碳酸鹽緩沖液、無菌生理鹽水、異硫氰酸熒光素、1%硫柳汞水溶液、三角燒瓶（25～50ml）、冰及冰槽（或1000ml燒杯）、電磁攪拌器、滅菌吸管、透析袋、玻棒、棉線及燒杯（500ml）、pH7.2或8.0的0.01

mol/L PBS等。

方法及步驟：

①抗體的準備：取適量已知球蛋白濃度之溶液，置入三角燒瓶中，加入生理鹽水及碳酸鹽緩沖液，使zui后蛋白濃度為20mg/ml，緩沖液容量為總量的1/10，混勻，將三角燒瓶置冰槽中，電磁攪拌（速度適當以不起泡沫為宜）5～10min。

②熒光素的準備：根據欲標記的蛋白質總量，按每毫克蛋白加0.01mg

熒光素，用分析天平準確稱所取所需的異硫氰酸熒光素粉末。

③結合（或稱標記）：邊攪拌邊將稱取的熒光色素漸漸加入球蛋白溶液中，避免將熒光素粘于三角燒瓶壁或攪拌玻棒上（大約5～10min內加完），加畢后，繼續(xù)攪拌12～18h。結合期間應保持蛋白溶液于4℃左右，故須及時添冰去水；亦可將結合裝置安放在4℃冰箱或冰庫中。

④透析：結合完畢后，將球蛋白的溶液離心（2500r/min）20min，除去其中少量之沉淀物，裝入透析袋中后再置于燒杯中，用pH8.0緩沖鹽水透

析（0～4℃）過夜。

⑤過柱：取透析過夜的標記物，過葡聚糖凝膠G-25或G-50柱，分離游離熒光素，收集標記的熒光抗體進行鑒定。