Trizol總RNA提取試劑
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一、 試劑盒說(shuō)明
上海勁馬-TRIzol 是一種快捷方便的總 RNA 提取試劑，可以從動(dòng)物組織、各種微生物及細(xì)胞等中提取總 RNA。在樣品處
理過(guò)程中，TRIzol 可*充分裂解樣品，同時(shí)保持 RNA 的完整性。加入氯-仿離心后，溶液形成上清層（水相）、中間層
和有機(jī)相（下層）。取出上清層，可用異丙醇沉淀回收 RNA；中間層用乙醇沉淀回收 DNA；有機(jī)相可用異丙醇沉淀回收
蛋白。
 上海勁馬TRIzol 試劑可用于少量樣品的 RNA 提取，也可用于大量樣品的 RNA 提取。提取 RNA 整個(gè)過(guò)程方便快速，整
個(gè)操作過(guò)程可一個(gè)小時(shí)內(nèi)完成，提取的 RNA 無(wú)蛋白和 DNA 的污染，純度髙，可直接用于 Northern Blotting、斑點(diǎn)雜交、
polyA 篩選、mRNA 純化、體外翻譯、RNase 保護(hù)分析、RT-PCR、構(gòu)建 cDNA 文庫(kù)等各種分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。
二、 試劑盒組份

TRIzol 試劑 20 mL 50 mL 100 mL
三、 操作步驟
RNA 提取過(guò)程的關(guān)鍵是建立一個(gè)無(wú) RNase 的實(shí)驗(yàn)環(huán)境，因此在整個(gè)操作過(guò)程中要防止 RNase 的污染，應(yīng)注意
以下幾點(diǎn)：
1. 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中經(jīng)常更換新手套，使用超凈臺(tái)，在操作過(guò)程中避免講話；
2. 應(yīng)盡量使用無(wú) RNase 的實(shí)驗(yàn)器材；槍頭、塑料制品和玻璃制品可以用 0.1％DEPC水溶液在 37℃
處理過(guò)夜，然后在 120℃下高壓滅菌 30min 以去除殘留的 DEPC。玻璃制品也可用干熱滅菌去除 RNase（180℃
烘烤 2h）；
3. 配制溶液應(yīng)使用無(wú) RNase 水（無(wú) RNase 水的配制方法：雙蒸水加入 DEPC 至終濃度 0.01％ V/V，放置過(guò)夜，然
后 120℃下高壓滅菌 30min，備用）；
4. 整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中使用的試劑，實(shí)驗(yàn)器材和無(wú) RNase 水應(yīng)，避免交叉污染。
用戶自備試劑：氯-仿、異丙醇、75％乙醇（用 DEPC 處理過(guò)的水配制）、無(wú) RNase 的無(wú)菌水。
1． 樣品處理
A 貼壁培養(yǎng)細(xì)胞
1 倒凈培養(yǎng)液；
2 每 10cm2生長(zhǎng)的培養(yǎng)細(xì)胞中加入 1mL 凱基 TRIzol 試劑，在室溫下水平放置 5min，使裂解液均勻分布于細(xì)胞表
面，然后用移液槍吹打細(xì)胞使細(xì)胞脫落；
3 將細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)移至離心管中，并用 1mL 槍頭反復(fù)吹打直至裂解液中無(wú)明顯沉淀，在室溫下放置 5min，使得
核酸蛋白復(fù)合物*分離；
B 懸浮培養(yǎng)細(xì)胞
1 直接離心收集細(xì)胞，倒凈培養(yǎng)液；
2 細(xì)胞沉淀中每 5～10×10
6細(xì)胞加入 1mL 凱基 TRIzol 試劑；
3 將細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)移至離心管中，并用 1ml 槍頭反復(fù)吹打直至裂解液中無(wú)明顯沉淀，在室溫下放 置 5min，使
得核酸蛋白復(fù)合物*分離；C 動(dòng)、植物組織材料
1 將組織在液氮中磨碎成粉末狀（應(yīng)無(wú)明顯顆粒）；
2 每 50～100mg 的組織加 1mL 上海勁馬 TRIzol 試劑，樣品的體積不應(yīng)超過(guò) TRIzol 試劑體積的 10％，并用勻漿器進(jìn)
行勻漿，直至勻漿液呈無(wú)顆粒透明狀；
3 將細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)移至離心管中，在室溫下放置 5min，使得核酸蛋白復(fù)合物*分離；
4 12,000g， 4℃離心 10min，然后小心吸取上清液，移入新的離心管中；
2． 向上述步驟 1 得到的裂解液中加入氯-仿（每使用 1mL 上海勁馬 TRIzol 加 0.2mL 氯-仿），蓋緊離心管管蓋，用手上下振蕩
15s（請(qǐng)勿渦漩激烈振蕩），得桔紅色渾濁液，無(wú)分層現(xiàn)象，室溫靜置 3min；
3． 12,000g，4℃離心 15min；
4． 取出離心管，樣品分為三層：黃色的上清水相、中間的白色層及粉紅色的下層有機(jī)相。小心吸取黃色上清水相移至
另一離心管，水相的體積約為所用上海勁馬 TRIzol 試劑的 60％；
5． 向步驟 4 得到的上清水相加入等體積的異丙醇，輕輕混勻，室溫靜置 10min；
6． 12,000g，4℃離心 10min；
7． 小心去除上清，緩慢沿管壁加入 1mL75％的乙醇（用 DEPC 處理過(guò)的水配制），輕輕混勻。每使用 1mL 上海勁馬 TRIzol
試劑至少加 1mL 75％的乙醇；
8． 12,000g，4℃離心 10min；
9． 小心吸盡上清；
10．室溫干燥沉淀 2～5min（不可晾得太干，否則 RNA 將會(huì)很難溶解），加入 30～50μL 的無(wú) RNase 水溶解 RNA 沉淀，
待*溶解后于-70℃保存。取 RNA 樣品用 1×TE Buffer（見(jiàn)備注）稀釋樣品 100 倍或適當(dāng)?shù)谋稊?shù)，測(cè)定樣品在 260nm
和 280 nm 的吸收值確定 RNA 的質(zhì)量。
RNA 的濃度＝OD260×稀釋倍數(shù)×0.04μg/μL，OD260/280 在 1.8～2.1 視為抽提的 RNA 的純度很高。
四、 注意事項(xiàng)
本試劑含強(qiáng)變性劑，應(yīng)避免與皮膚接觸，如接觸皮膚，應(yīng)立即用大量的水沖洗，根據(jù)需要情況到醫(yī)院處理。本
品含有酚類、巰基-乙醇等成分，具有特殊氣味，請(qǐng)于吸取試劑溶液后馬上蓋好瓶蓋，或于通風(fēng)櫥中操作。
五、 常見(jiàn)問(wèn)題分析以及解決方案
1. 一般情況下每毫克的組織或 1×10
6個(gè)細(xì)胞中所能提取的 RNA 量見(jiàn)下表：
組織材料 TotalRNA 提取量
上皮細(xì)胞 約 10μg
成纖維細(xì)胞 約 6μg
肝臟 約 5μg
腎臟 約 3μg
肌肉或腦 約 1.5μg
2. 常見(jiàn)問(wèn)題以及解決方案
常見(jiàn)問(wèn)題 可能原因 建議解決方案
產(chǎn)率低
含有裂解液的樣品經(jīng)勻漿混勻后未在
室溫靜置，或靜置的時(shí)間不足 5 分鐘
嚴(yán)格按照說(shuō)明書操作
RNA 不*溶解 縮短晾干時(shí)間
三相分離時(shí)，吸取上清液不* 盡量回收上清液
A260/A280＜1.65
測(cè)定 OD 值時(shí)用的是水溶液 更換測(cè)定 OD 值時(shí)的溶液，用 TE
Buffer
TRIzol 加量太少，造成蛋白質(zhì)變性不
充分
嚴(yán)格按照說(shuō)明書操作含有裂解液的樣品經(jīng)勻漿混勻后未在
室溫靜置，或靜置的時(shí)間不足 5 分鐘
嚴(yán)格按照說(shuō)明書操作
RNA 不*溶解 縮短晾干時(shí)間
三相分離后，吸取上清液時(shí)不小心接
觸蛋白層造成污染
小心吸取上清
RNA 降解
使用的組織材料不夠新鮮 提取 RNA 的組織材料應(yīng)采用新鮮
的組織材料，或?qū)⑿迈r的組織材料
用液氮迅速冷凍后置于-80℃保存
細(xì)胞用胰酶消化 不要用胰酶消化細(xì)胞
提取 RNA 時(shí)使用的試劑及器材中有
RNase 污染
做好試驗(yàn)前的準(zhǔn)備工作，保證無(wú)
RNase 污染
提取的組織材料中含有大量的 RNase 加大 TRIzol 的用量
DNA 污染
裂解組織或細(xì)胞使用的 TRIzol 量偏少 加大 TRIzol 的用量
使用的組織材料中含有大量的有機(jī)溶
劑（如：乙醇、異丙醇等)、高濃度的
Buffer、堿性溶劑等
用 DEPC 水充分洗滌組織
多糖的污染
多糖的理化學(xué)性質(zhì)與 RNA 十分接近，
因此很難將其從 RNA 中除去
加大 TRIzol 的用量