活性蛋白提取試劑盒使用操作說(shuō)明

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一、 試劑盒說(shuō)明

本試劑盒用于從哺乳動(dòng)物組織和培養(yǎng)細(xì)胞中提取具有活性的全蛋白， 用含有蛋白酶抑制劑及磷酸酶抑制劑的裂解緩沖液

Lysis Buffer 勻漿裂解組織或細(xì)胞，作用溫和，提取過(guò)程簡(jiǎn)便。獲得的全蛋白可用于 Western Blot、免疫共沉淀和酶 的活性的測(cè)定的等后續(xù)研究，但不能用于蛋白激酶及磷酸酶免疫共沉淀的研究，因本試劑盒中包括這兩種酶的抑制劑。 應(yīng)用方面：可用于 Western Blot、免疫共沉淀和酶活性測(cè)定等后續(xù)研究.

二、試劑盒組份

三、操作步驟

Ⅰ 實(shí)體組織蛋白的提取

1． 在每 mL 冷 Lysis Buffer 加入 10 μL 磷酸酶抑制劑，1 μL 蛋白酶抑制劑和 10μL PMSF，混勻。冰上保存數(shù)分鐘待 用。

2．  每 100mg 固體組織置于培養(yǎng)皿中，手術(shù)剪剪碎成 3mm×3mm 左右的小塊，加入 0.5～1 mL 冷 Lysis Buffer，玻 璃勻漿器上下手動(dòng)勻漿 15 次，注意低溫操作；

3． 取組織勻漿液轉(zhuǎn)移到 1.5mL 預(yù)冷的離心管，離心 10000 轉(zhuǎn)/分，4℃離心 5 min；

4．  取上清轉(zhuǎn)移至新的預(yù)冷的離心管中，即為全蛋白提取物，蛋白定量（Bradford 法、BCA 法）；

5． 分裝保存于-70℃,避免反復(fù)凍融。

Ⅱ    培養(yǎng)細(xì)胞蛋白提取

1． 貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞，吸去培養(yǎng)基后，加入 10mL/150mm 培養(yǎng)板的冷 PBS 洗兩次，每次振搖數(shù)次以盡量去除培養(yǎng)液；

2．  懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞或用細(xì)胞刮子刮下的貼壁細(xì)胞，將細(xì)胞及培養(yǎng)液移至離心管中，1000 轉(zhuǎn)/分離心 10 min，再用

10mL/150mm 培養(yǎng)板的冷 PBS，1000 轉(zhuǎn)/分離心 5 min 洗兩次；

3．  在每 mL 冷 Lysis Buffer 加入 10μL 磷酸酶抑制劑，1μL 蛋白酶抑制劑和 10μL PMSF（用戶(hù)自配：濃度 100mM， 溶于異丙醇），混勻。冰上保存數(shù)分鐘待用。

4． 在上述培養(yǎng)板或離心管的細(xì)胞中，加入上述配制好的冷 Lysis Buffer，加入量如下表所示：

5．冷室或冰上操作，貼壁細(xì)胞用細(xì)胞刮子刮下，皆 Lysis Buffer 一同轉(zhuǎn)移至新的預(yù)冷的離心管中；懸浮培養(yǎng)或裂解

前刮下的貼壁細(xì)胞皆 Lysis Buffer 一同轉(zhuǎn)移至新的預(yù)冷的離心管中，

6．置于 4℃搖床平臺(tái)上，溫和振蕩 15 min；

7． 14,000rpm，4℃離心 15min，取上清為全蛋白提取物, 蛋白定量（Bradford 法、BCA 法）；

8．  分裝保存于-70℃,避免反復(fù)凍融。

四、注意事項(xiàng)

?      所有接觸樣品的用具及試劑均需預(yù)冷。

?      提取蛋白后，如有必要，可透析除去表面活性劑