免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎(chǔ)的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法。是確定兩種蛋白質(zhì)在完整細(xì)胞內(nèi)生理性相互作用的有效方法。
注意：在準(zhǔn)備做磷酸（酯）酶實(shí)驗(yàn)的時(shí)候，不加磷酸酯酶抑制劑。
一.工作液配制：
配制100ml的modified RIPA buffe：
1、稱取790mg的Tris-Base，加到75ml去離子水中，加入900mg的NaCl，攪拌，直到全部溶解，用 HCl調(diào)節(jié)PH值到7.4；
2、加10ml 10%的NP-40；
3、加2.5ml 10%的去氧膽酸鈉，攪拌，直到溶液澄清；
4、加1ml 100mM的EDTA，用量筒定容到100ml，2～8℃ 保存；
5、理論上，蛋白酶和磷酸酯酶抑制劑應(yīng)該在使用當(dāng)天同時(shí)加入（抑蛋白酶肽，亮抑酶肽, 胃蛋白酶抑制劑各100μl；PMSF，Na3VO4，NaF各500μl），但是PMSF在水溶液中很不穩(wěn)定，30分鐘就會(huì)降解一半，所以PMSF應(yīng)該在使用前現(xiàn)加，其他抑制劑成分可以在水溶液中穩(wěn)定5天。
二.各種成分在工作液中的終濃度：
Tris-HCl：50mM，pH7.4
NP-40：1%
去氧膽酸鈉：0.25%
NaCl：150mM
EDTA：1mM
PMSF：1mM
抑蛋白酶肽，亮抑酶肽，胃蛋白酶抑制劑：各1μg/ml
Na3VO4：1mM
NaF：1mM
三.實(shí)驗(yàn)步驟：
1、轉(zhuǎn)染后24～48h可收獲細(xì)胞，加入適量細(xì)胞裂解緩沖液（含蛋白酶抑制劑），冰上裂解30min，細(xì)胞裂解液于4℃，zui大轉(zhuǎn)速離心30min 后取上清；
2、取少量裂解液以備Western blot分析，剩余裂解液加1μg相應(yīng)的抗體加入到細(xì)胞裂解液，4℃緩慢搖晃孵育過夜；
3、取10μl protein A瓊脂糖珠，用適量裂解緩沖液洗3次，每次3000rpm，離心3min；
4、將預(yù)處理過的10μl protein A瓊脂糖珠加入到和抗體孵育過夜的細(xì)胞裂解液中4℃ 緩慢搖晃孵育 2～4h，使抗體與protein A瓊脂糖珠偶連；
5、免疫沉淀反應(yīng)后，在4℃以3000rpm 速度離心3min，將瓊脂糖珠離心至管底；將上清小心吸去，瓊脂糖珠用1ml裂解緩沖液洗3～4次；zui后加入15μl的2×SDS上樣緩沖液，沸水煮5分鐘；
6、SDS-PAGE，Western blotting或質(zhì)譜儀分析。
四.通過免疫共沉淀確定結(jié)合蛋白：
1、用磷酸鹽緩沖液洗30塊10cm 培養(yǎng)板上的適宜細(xì)胞。刮去每塊板上的細(xì)胞到1ml冰冷的EBC 裂解緩沖液中。
2、將每毫升細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到微量離心管中，在微量離心機(jī)上4℃ 以zui大速度離心15min。
3、收集上清（約30ml）并加入30μg的適當(dāng)抗體，4℃搖動(dòng)免疫沉淀物1h。
4、加入0.9ml的蛋白質(zhì)A-Sepharose 懸液，4℃搖動(dòng)免疫沉淀物30min。
5、用含900mmol/L NaCl的NETN洗蛋白A-Sepharose混合物，再重復(fù)洗5次。zui后，用NETN洗一次。
6、吸出混合物的液體部分。加入800μl的1×SDS膠加樣緩沖液到球珠中，煮沸4min。
7、將樣品加入到大孔的不連續(xù) SDS-PAGE梯度膠中，在10mA的恒定電流下電泳過夜。
8、通過考馬斯藍(lán)染色觀察蛋白質(zhì)泳帶。
9、從膠上切下目標(biāo)帶，將其放到微量離心管中，用1ml50% 乙腈洗兩次，每次3min。
10、用胰蛋白酶消化膠中的蛋白質(zhì)，再將肽電洗脫。
11、通過窄孔液相色譜分離肽。將收集的肽在ABI477A或494A機(jī)器上進(jìn)行自動(dòng)Edman降解測序。
五.注意事項(xiàng)：
1、細(xì)胞裂解采用溫和的裂解條件，不能破壞細(xì)胞內(nèi)存在的所有蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用，多采用非離子變性劑（NP40或Triton X-100）。每種細(xì)胞的裂解條件是不一樣的，通過經(jīng)驗(yàn)確定。不能用高濃度的變性劑（0.2％ SDS），細(xì)胞裂解液中要加各種酶抑制劑，如商品化的cocktailer。
2、使用明確的抗體，可以將幾種抗體共同使用。
3、使用對(duì)照抗體：
① 單克隆抗體：正常小鼠的IgG或另一類單抗
② 兔多克隆抗體：正常兔IgG
4、在免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)中要保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的真實(shí)性，應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：
① 確保共沉淀的蛋白是由所加入的抗體沉淀得到的，而并非外源非特異蛋白，單克隆抗體的使用有助于避免污染的發(fā)生
② 要確?？贵w的特異性，即在不表達(dá)抗原的細(xì)胞溶解物中添加抗體后不會(huì)引起共沉淀
③ 確定蛋白間的相互作用是發(fā)生在細(xì)胞中，而不是由于細(xì)胞的溶解才發(fā)生的，這需要進(jìn)行蛋白質(zhì)的定位來確定。