預(yù)期應(yīng)用

　　ELISA法定量測(cè)定人血清、血漿或其它相關(guān)生物液體中FETU-A含量。

實(shí)驗(yàn)原理

　　人胎球蛋白A ELISA試劑盒用純化的FETU-A抗體包被微孔板，制成固相載體，往微孔中依次加入標(biāo)本或標(biāo)準(zhǔn)品、生物素化的FETU-A抗體、HRP標(biāo)記的親和素，經(jīng)過(guò)*洗滌后用底物（TMB）顯色。TMB在過(guò)氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的FETU-A呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（值），計(jì)算樣品濃度。

試劑盒組成及試劑配制

　　1、 酶標(biāo)板：一塊（96孔）

　　2、 標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）： 2瓶，請(qǐng)臨用前15分鐘內(nèi)配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至1ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時(shí)反復(fù)顛倒/搓動(dòng)以助溶解，其濃度為5,000 ng/ml，然后做系列倍比稀釋（注：不要直接在板中進(jìn)行倍比稀釋），分別配制成5,000 ng/ml，2,500 ng/ml，1,250 ng/ml，625 ng/ml，312 ng/ml，156 ng/ml，78 ng/ml，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 ng/ml。如配制2,500 ng/ml標(biāo)準(zhǔn)品：取0.5ml （不要少于0.5ml ）5,000 ng/ml的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。

　　3、 樣品稀釋液：1×20ml。

　　4、 檢測(cè)稀釋液A：1×10ml。

　　5、 檢測(cè)稀釋液B：1×10ml。

　　6、檢測(cè)溶液A：1×120 /瓶（1:100）。臨用前以檢測(cè)稀釋液A1:100稀釋（如：10 檢測(cè)溶液A /990 檢測(cè)稀釋液A），充分混勻，稀釋前根據(jù)預(yù)先計(jì)算好的每次實(shí)驗(yàn)所需的總量配制（100 /孔），實(shí)際配制時(shí)應(yīng)多配制 0.1-0.2ml。

　　7、檢測(cè)溶液B：1×120 /瓶（1:100）。臨用前以檢測(cè)稀釋液B1:100稀釋。稀釋方法同檢測(cè)溶液A。

　　8、 底物溶液：1×10ml/瓶。

　　9、 濃洗滌液：1×30ml/瓶，使用時(shí)每瓶用蒸餾水稀釋25倍。

　　10、終止液：1×10ml/瓶（2 mol/LH2SO4）。

　　11、覆膜：5張

　　12、使用說(shuō)明書：1份

自備物品

　　1、酶標(biāo)儀（建議儀器使用前提前預(yù)熱）

　　2、微量加液器及吸頭，EP管

　　3、蒸餾水或去離子水，濾紙標(biāo)本的采集及保存

　　1、血清：全血標(biāo)本請(qǐng)于室溫放置2小時(shí)或4 過(guò)夜后于1000g離心20分鐘，取上清即可檢測(cè)，或?qū)⑸锨逯糜?span lang="EN-US">-20 或-80 保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

　　2、血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于1000 g離心15分鐘，取上清即可檢測(cè)，或?qū)⑸锨逯糜?span lang="EN-US">-20 或-80 保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

　　3、其它生物標(biāo)本：請(qǐng)1000g離心20分鐘，取上清即可檢測(cè)，或?qū)⑸锨逯糜?span lang="EN-US">-20 或-80 保 存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

　　4、樣本處理：血清或血漿標(biāo)本推薦稀釋200倍。標(biāo)本使用0.02 M 的PBS稀釋（PH=7.0-7.2）。

　　注：以上標(biāo)本均應(yīng)密封保存，4保存應(yīng)小于1周，-20不應(yīng)超過(guò)1個(gè)月，-80不應(yīng)超過(guò)2個(gè)月;標(biāo)本溶血會(huì)影響zui后檢測(cè)結(jié)果，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測(cè)。

操作步驟

　　實(shí)驗(yàn)開始前，各試劑均應(yīng)平衡至室溫，試劑不能直接在37 溶解;試劑或樣品配制時(shí)，均需充分混勻，混勻時(shí)盡量避免起泡。實(shí)驗(yàn)前應(yīng)預(yù)測(cè)樣品含量，如樣品濃度過(guò)高時(shí)，應(yīng)對(duì)樣品進(jìn)行稀釋，以使稀釋后的樣品符合試劑盒的檢測(cè)范圍，計(jì)算時(shí)再乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。

　　1、加樣：分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔。空白孔加樣品稀釋液 100 ，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品100 ，注意不要有氣泡，加樣 時(shí)將樣品加于酶標(biāo)板底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜，37 溫育2小時(shí)。為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效性，每次實(shí)驗(yàn)請(qǐng)使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

　　2、棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加檢測(cè)溶液A工作液100 （臨用前配制），酶標(biāo)板加上覆膜，37 溫育1小時(shí)。

　　3、棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板 3次，每次浸泡1-2分鐘，大約400 /每孔，甩干（也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干）。

　　4、每孔加檢測(cè)溶液B工作液（臨用前配制）100 ，加上覆膜，37 溫育1小時(shí)。

　　5、棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次，方法同步驟3。

　　6、每孔加底物溶液90 ，酶標(biāo)板加上覆膜37 避光顯色（反應(yīng)時(shí)間控制在15-30分鐘，當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)孔的前3-4孔有明顯的梯度藍(lán)色，后3-4孔梯度不明顯時(shí)，即可終止）。

　　7、每孔加終止溶液50 ，終止反應(yīng)，此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同。

　　8、立即用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)測(cè)量各孔的光密度（值）。

　　注：

　　1、 試劑準(zhǔn)備：所有試劑在使用前應(yīng)平衡至室溫，使用后請(qǐng)立即按照說(shuō)明書要求保存試劑。實(shí)驗(yàn)操作中請(qǐng)使用一次性的吸頭，避免交叉污染。

　　2、 加樣：加樣或加試劑時(shí)，*個(gè)孔與zui后一個(gè)孔加樣之間的時(shí)間間隔如果太大，將會(huì)導(dǎo)致不同的“預(yù)溫育”時(shí)間，從而明顯地影響到測(cè)量值的準(zhǔn)確性及重復(fù)性。一次加樣時(shí)間（包括標(biāo)準(zhǔn)品及所有樣品）控制在10分鐘內(nèi)。推薦設(shè)置復(fù)孔進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

　　3、 溫育：為防止樣品蒸發(fā)，實(shí)驗(yàn)時(shí)將加上蓋或覆膜的酶標(biāo)板置于濕盒內(nèi)，以避免液體蒸發(fā);洗板后應(yīng)盡快進(jìn)行下步操作，任何時(shí)侯都應(yīng)避免酶標(biāo)板處于干燥狀態(tài);同時(shí)應(yīng)嚴(yán)格遵守給定的溫育時(shí)間和溫度。

　　4、 洗滌：洗滌過(guò)程中反應(yīng)孔中殘留的洗滌液應(yīng)在濾紙上拍干，勿將濾紙直接放入反應(yīng)孔中吸水，同時(shí)要消除板底殘留的液體和手指印，避免影響zui后的酶標(biāo)儀讀數(shù)。

　　5、試劑配制：Detection A及DetectionB在使用前請(qǐng)手甩幾下或少時(shí)離心處理，以使管壁或瓶蓋的液體沉積到管底。標(biāo)準(zhǔn)品、檢測(cè)溶液A工作液、檢測(cè)溶液B工作液請(qǐng)依據(jù)所需的量配制使用，并使用相應(yīng)的稀釋液配制，不能混淆。請(qǐng)配制標(biāo)準(zhǔn)品及工作液，盡量不要微量配制（如吸取檢測(cè)溶液A時(shí)，一次不要小于10 ），以避免由于不準(zhǔn)確稀 釋而造成濃度誤差;請(qǐng)勿重復(fù)使用已稀釋過(guò)的標(biāo)準(zhǔn)品、檢測(cè)溶液A工作液、檢測(cè)溶液B工作液。

　　6、 反應(yīng)時(shí)間的控制：加入底物后請(qǐng)定時(shí)觀察反應(yīng)孔的顏色變化（比如，每隔10分鐘），如顏色較深，請(qǐng)?zhí)崆凹尤虢K止液終止反應(yīng)，避免反應(yīng)過(guò)強(qiáng)從而影響酶標(biāo)儀光密度讀數(shù)。

　　7、 底物：底物請(qǐng)避光保存，在儲(chǔ)存和溫育時(shí)避免強(qiáng)光直接照射。

洗板方法

　　1、手工洗板方法：將推薦的洗滌緩沖液至少0.4ml注入孔內(nèi)，浸泡1-2分鐘，吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體，在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上鋪墊幾層吸水紙，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次;根據(jù)需要，重復(fù)此過(guò)程數(shù)次。

　　2、自動(dòng)洗板：如果有自動(dòng)洗板機(jī)，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實(shí)驗(yàn)過(guò)程中。

特異性

　　人胎球蛋白A ELISA試劑盒可同時(shí)檢測(cè)重組或天然的人FETU-A，且與其它相關(guān)蛋白無(wú)交叉反應(yīng)。

計(jì)算

　　各標(biāo)準(zhǔn)品及樣本值扣除空白孔 值后作圖（七點(diǎn)圖），如設(shè)置復(fù)孔，則應(yīng)取其平均值計(jì)算。以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為縱坐標(biāo)（對(duì)數(shù)坐標(biāo)），值為橫坐標(biāo)（對(duì)數(shù)坐標(biāo)），在對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。推薦使用專業(yè)制作曲線軟件進(jìn)行分析，如 curve expert 1.3，根據(jù)樣品值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度，乘以稀釋倍數(shù);或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與 值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程式，將樣品的值代入方程式，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。

　　檢測(cè)范圍：78 ng/ml - 5,000 ng/ml，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線請(qǐng)取用以下濃度值：5,000 ng/ml，2,500 ng/ml，1,250 ng/ml，625 ng/ml，312 ng/ml，156 ng/ml，78 ng/ml。

　　zui低檢測(cè)限：19.5 ng/ml

說(shuō)明

　　1、 由于現(xiàn)有條件及科學(xué)技術(shù)水平尚不能對(duì)所有供貨商提供的所有原料進(jìn)行全面的鑒定與分析，

　　本產(chǎn)品可能存在一定的質(zhì)量技術(shù)風(fēng)險(xiǎn)。

　　2、 zui終的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與試劑的有效性、實(shí)驗(yàn)者的相關(guān)操作以及當(dāng)時(shí)的實(shí)驗(yàn)環(huán)境密切相關(guān)，請(qǐng)務(wù)必

　　準(zhǔn)備充足的標(biāo)本備份。

　　3、在儲(chǔ)存及溫育過(guò)程中避免將試劑暴露在強(qiáng)光中。所有試劑瓶蓋須蓋緊以防止蒸發(fā)和微生物的 污染，因?yàn)榈鞍姿饷傅母蓴_將導(dǎo)致出現(xiàn)錯(cuò)誤的結(jié)果。

　　4、試劑盒保存：請(qǐng)收到試劑盒后盡快將標(biāo)準(zhǔn)品、檢測(cè)溶液A和檢測(cè)溶液B保存于-20，其余試劑短期保存請(qǐng)置于4，長(zhǎng)期保存則置于-20。開封后的酶標(biāo)板要密封加干燥劑后保存于-20，避免潮濕。

　　5、 濃洗滌液會(huì)有鹽析出，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶。

　　6、剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會(huì)有少許水樣物質(zhì)，此為正常現(xiàn)象，不會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成任何影響。

　　7、 有效期：6個(gè)月。

　　8、 人胎球蛋白A ELISA試劑盒操作說(shuō)明適用于48T試劑盒，但48T試劑盒所有試劑減半。