實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?1．了解用逆轉(zhuǎn)錄PCR法獲取目的基因的原理。2．學(xué)習(xí)和掌握逆轉(zhuǎn)錄PCR的技術(shù)和方法。 【實(shí)驗(yàn)原理】 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）過程利用模板變性，引物退火和引物延伸的多個(gè)循環(huán)來擴(kuò)增DNA序列。因?yàn)樯弦惠喌臄U(kuò)增產(chǎn)物又作為下一輪擴(kuò)增的模板，是一個(gè)指數(shù)增長的過程，使其成為檢測(cè)核酸和克隆基因的一種非常靈敏的技術(shù)。一般經(jīng)25-35輪循環(huán)就可使模板DNA擴(kuò)增達(dá)106 倍。RT-PCR將以RNA為模板的cDNA（complement DNA）合成（即RNA的反轉(zhuǎn)錄（RT，reversetranscription）），同cDNA的PCR結(jié)合在一起的技術(shù)，提供了一種基因表達(dá)檢測(cè)、定量和cDNA克隆的快速靈敏的方法。由于cDNA包括了編碼蛋白的完整序列而且不含內(nèi)含子，只要略經(jīng)改造便可直接用于基因工程表達(dá)和功能研究，因此RT-PCR成為目前獲得目的基因的一種重要手段。RT-PCR技術(shù)靈敏而且用途廣泛，可用于檢測(cè)細(xì)胞中基因表達(dá)水平、表達(dá)差異，細(xì)胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。RT-PCR比其他包括Northern印跡、RNase保護(hù)分析、原位雜交及S1核酸酶分析在內(nèi)的RNA分析技術(shù)，更靈敏，更易于操作。RT-PCR的基本原理（圖4.1）。首先是在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下從RNA合成 cDNA，即總RNA中的mRNA在體外被反向轉(zhuǎn)錄合成DNA拷貝，因拷貝DNA的核苷酸序列*互補(bǔ)于模板mRNA，稱之為互補(bǔ)DNA（cDNA）；然后再利用DNA聚合酶，以cDNA*鏈為模板，以四種脫氧核苷三磷酸（dNTP）為材料，在引物的引導(dǎo)下復(fù)制出大量的cDNA或目的片段。在RT時(shí)，有3種引物可選擇 （表4.1） 。用1）和2）方法，理論上是擴(kuò)增的所有的cDNA，還要用此產(chǎn)物做PCR的模板繼續(xù)擴(kuò)增。如果用3）方法，先要去http://www.ncbi.nlm.nih.gov查它的序列，并用oligo等軟件設(shè)計(jì)引物。RT-PCR可以一步法或兩步法的形式進(jìn)行。兩步法RT-PCR比較常見，在使用一個(gè)樣品檢測(cè)或克隆多個(gè)基因的mRNA時(shí)比較有用。在兩步法RT-PCR中，每一步都在*條件下進(jìn)行。cDNA的合成首先在逆轉(zhuǎn)錄緩沖液中進(jìn)行，然后取出1/10的反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行PCR。而一步法RT-PCR具有其它優(yōu)點(diǎn)（表4.2），cDNA合成和擴(kuò)增反應(yīng)在同一管中進(jìn)行，不需要打開管蓋和轉(zhuǎn)移，有助于減少污染。還可以得到更高的靈敏度，zui低可以達(dá)到0.1pg總RNA，因?yàn)檎麄€(gè)cDNA樣品都被擴(kuò)增。對(duì)于成功的一步法RT-PCR，一般使用基因特異性引物（GSP）起始cDNA的合成。由圖4.1不難看出，隨機(jī)引物法是三種方法中特異性zui低的。引物在整個(gè)轉(zhuǎn)錄本的多個(gè)位點(diǎn)退火，產(chǎn)生短的，部分長度的cDNA。這種方法經(jīng)常用于獲取5"末端序列及從帶有二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)域或帶有逆轉(zhuǎn)錄酶不能復(fù)制的終止位點(diǎn)的RNA模板獲得cDNA。為了獲得zui長的cDNA，需要按經(jīng)驗(yàn)確定每個(gè)RNA樣品中引物與RNA的比例。隨機(jī)引物的起始濃度范圍為50到250ng每20μl反應(yīng)體系。因?yàn)槭褂秒S機(jī)引物從總RNA合成的cDNA主要是核糖體RNA，所以模板一般選用poly（A）+RNA。Oligo（dT）起始比隨機(jī)引物特異性高。它同大多數(shù)真核細(xì)胞mRNA 3"端所發(fā)現(xiàn)的poly（A）尾雜交。因?yàn)閜oly（A）+RNA大概占總RNA的1%到2％，所以與使用隨機(jī)引物相比，cDNA的數(shù)量和復(fù)雜度要少得多。因?yàn)槠漭^高的特異性，oligo（dT）一般不需要對(duì)RNA和引物的比例及poly（A）+選擇進(jìn)行優(yōu)化。建議每20μl反應(yīng)體系使用0.5μg oligo（dT）。oligo（dT）12-18適用于多數(shù)RT-PCR?；蛱禺愋砸铮℅SP）對(duì)于逆轉(zhuǎn)錄步驟是特異性的引物。GSP是反義寡聚核苷，可以特異性地同RNA目的序列雜交，而不象隨機(jī)引物或oligo（dT）那樣同所有RNA退火。用于設(shè)計(jì)PCR引物的規(guī)則同樣適用于逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)GSP的設(shè)計(jì)。GSP可以同與mRNA 3"zui末端退火的擴(kuò)增引物序列相同，或GSP可以設(shè)計(jì)為與反向擴(kuò)增引物的下游退火。已經(jīng)制備好的雙鏈cDNA和一般DNA一樣，可以插入到質(zhì)?；蚴删w中，為此，首先必需有適當(dāng)?shù)慕宇^（Linker），接頭可以是在PCR引物上增加限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)片段，經(jīng)PCR擴(kuò)增后再克隆入相應(yīng)的載體；也可以利用末端轉(zhuǎn)移酶在載體和雙鏈cDNA的末端接上一段寡聚dG和dC或dT和dA尾巴,退火后形成重組質(zhì)粒,并轉(zhuǎn)化到宿主菌中進(jìn)行擴(kuò)增。本實(shí)驗(yàn)是要從小鼠肝臟組織中獲取Fas配體基因，F(xiàn)as配體（FasL）是一分子量約為40u的II型跨膜糖蛋白，屬TNF家族成員?；罨腡細(xì)胞可表達(dá)Fas和FasL，并通過Fas/FasL系統(tǒng)介導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用，保持機(jī)體免疫系統(tǒng)的自穩(wěn)態(tài)。近年研究發(fā)現(xiàn)在部分癌細(xì)胞中FasL表達(dá)增強(qiáng)，并與腫瘤的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移有關(guān)。我們采用RT-PCR方法克隆FasL全長cDNA并構(gòu)建其表達(dá)載體，可以為進(jìn)一步研究FasL的功能提供條件。在上下游引物的5’端分別加上了限制酶切位點(diǎn)及其保護(hù)堿基（即Hind III和BamH I），以便可以通過雙酶切將目的片段定向的克隆到原核表達(dá)載體pGFPUv上（附錄圖4.3）。為了便于后續(xù)實(shí)驗(yàn)可以用金屬螯和層析的方法分離和純化目的蛋白，我們改造了pGFPUv，在其上加了6×His標(biāo)簽。 【試劑與器材】 （一）試劑1.總RNA（或mRNA）2.RNA酶抑制蛋白（RNase Inhibitor） ：40 U/mL3.dNTP 混合物 （各10 mM）4.oligo（dT）12-18：2.5 ?mol/L5.10*逆轉(zhuǎn)錄合成緩沖液（10?RT buffer）：250 mmol/L Tris-HCl （pH8.3），375 mmol/L KCl，15 mmol/L MgCl26.AMV逆轉(zhuǎn)錄酶 5u/?L7.基因特異性5’和3’引物各20 ?mol/L8.Tap DNA聚合酶 5u/?L9.10*PCR緩沖液：500mmol/L KCl，100mmol/L Tris?Cl，在25℃下，pH9.0，1.0% Triton X-100，15mmol/L MgCl2。（二）器材1）PCR儀，2）PCR管，3）微量移液器 【操作方法】 （一）逆轉(zhuǎn)錄：1）建立RT反應(yīng)體系：2）渦旋混勻，42℃反應(yīng)1小時(shí)，95℃加熱5分鐘，然后置于冰上。（二）PCR擴(kuò)增：1）建立PCR反應(yīng)體系：2）將上述反應(yīng)體系渦旋混勻, 按下列程序運(yùn)行循環(huán)：step2-4運(yùn)行30個(gè)循環(huán)，其中復(fù)性溫度主要依據(jù)引物的不同而不同。（三）取10-20uL PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，余下的PCR產(chǎn)物-20℃保存。 【注意事項(xiàng)與提示】 1.逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)過程，需建立無RNAase環(huán)境，以避免RNA的降解。2.成功的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)決定于高質(zhì)量的模板RNA。高質(zhì)量的RNA至少應(yīng)保證全長并且不含逆轉(zhuǎn)錄酶的抑制劑，如EDTA或SDS。此外，RT-PCR所遇到的一個(gè)潛在的困難是RNA中沾染的基因組DNA。使用較好的RNA分離方法，如Trizol Reagent，會(huì)減少RNA制備物中沾染的基因組DNA。因此在進(jìn)行PCR反應(yīng)時(shí)應(yīng)該對(duì)每個(gè)RNA模板進(jìn)行一個(gè)無逆轉(zhuǎn)錄的對(duì)照反應(yīng)，以確定擴(kuò)增出來的片段是來自基因組DNA還是cDNA。在無逆轉(zhuǎn)錄時(shí)所得到的PCR產(chǎn)物來源于基因組。3.RT-PCR的起始模板可是總RNA或mRNA，都可以檢測(cè)到擴(kuò)增結(jié)果（如下圖）。另外，分離mRNA會(huì)導(dǎo)致樣品間mRNA豐度的波動(dòng)變化，從而使信息的檢出和定量產(chǎn)生偏差。然而，當(dāng)分析稀有基因時(shí)，使用mRNA會(huì)增加檢測(cè)的靈敏度。4.在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中經(jīng)常加入RNA酶抑制蛋白以增加cDNA合成的長度和產(chǎn)量。RNA酶抑制蛋白要在*鏈合成反應(yīng)中，在緩沖液和還原劑（如DTT）存在的條件下加入，因?yàn)閏DNA合成前的過程會(huì)使抑制劑變性，從而釋放結(jié)合的可以降解RNA的RNase。RNA酶抑制蛋白僅防止RNase A，B，C對(duì)RNA的降解，并不能防止皮膚上的RNase，因此盡管使用了這些抑制劑，也要小心試驗(yàn)者的手上Rnase對(duì)樣品的污染。5.較高的保溫溫度有助于RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的打開，增加了反應(yīng)的產(chǎn)量。對(duì)于多數(shù)RNA模板，在沒有緩沖液或鹽的條件下，將RNA和引物在65℃保溫，然后迅速置于冰上冷卻，可以消除大多數(shù)二級(jí)結(jié)構(gòu)，從而使引物可以結(jié)合。然而某些模板仍然會(huì)存在二級(jí)結(jié)構(gòu)，即使熱變性后也是如此。對(duì)這些困難模板的擴(kuò)增可以使用經(jīng)過改良的耐高溫逆轉(zhuǎn)錄酶， 如：Invitrogen 公司的ThermoScript逆轉(zhuǎn)錄酶，使逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)置于較高溫度下進(jìn)行以改善擴(kuò)增。而且適當(dāng)提高逆轉(zhuǎn)錄保溫溫度，可增加RT-PCR的特異性。6.建立反應(yīng)體系時(shí)，加完其它反應(yīng)物后，才加模板DNA和Taq DNA聚合酶；然后將全部反應(yīng)物渦旋混勻；上PCR儀前加礦物油封蓋或設(shè)熱蓋。7.PCR反應(yīng)的循環(huán)數(shù)一般25-30次就足夠了，過多的循環(huán)數(shù)會(huì)造成非特異性擴(kuò)增和時(shí)間的浪費(fèi)。復(fù)性溫度的計(jì)算，一般是在引物的Tm值上下浮動(dòng)，Tm =2（A+T）+4（G+C）。適當(dāng)提高復(fù)性溫度可提高PCR擴(kuò)增的特異性。8.不管是反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)還是PCR反應(yīng)都應(yīng)先調(diào)制試劑的Master Mix （包括RNase Free dH2O、緩沖液、dNTP Mixture等），然后分裝到每個(gè)反應(yīng)管中。這樣可使所取的試劑的體積更準(zhǔn)確，減少試劑的損失，避免重復(fù)分取同一試劑，同時(shí)也可以減少實(shí)驗(yàn)操作造成的誤差。而且分裝試劑時(shí)務(wù)*新Tip，以防止樣品間的污染。9.AMV、RNase Inhibitor、Taq等酶類，要輕輕地混勻，避免起泡。分取之前要輕輕地離心收集到反應(yīng)管底部，因其粘度高，所以要慢慢地分取。 酶類務(wù)必在實(shí)驗(yàn)前從-20℃取出，使用后立即放回-20℃保存。10.*的PCR條件，因PCR擴(kuò)增儀的不同而不同，所以在使用您的樣品之前先做Control反應(yīng)，以確定*的PCR條件。為延長PCR儀的使用壽命，應(yīng)盡可能縮短PCR儀4℃保存的時(shí)間，盡量避免4℃過夜的情況。Lane 1：總RNA 的 RT-PCR 產(chǎn)物（人細(xì)胞調(diào)亡因子TF15基因）Lane 2： mRNA 的 RT-PCR 產(chǎn)物，人細(xì)胞調(diào)亡因子TF15基因Lane 3： 100bp marker 【實(shí)驗(yàn)安排】 1．*天：試劑的配制和所用一次性塑料制品和玻璃器皿的去RNase處理（0.1%DEPC浸泡或高溫干烤）。2．第二天：進(jìn)行（一）逆轉(zhuǎn)錄和（二）PCR擴(kuò)增。3．第三天：進(jìn)行（三）瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。4．為了保證實(shí)驗(yàn)質(zhì)量，能將總RNA提取、mRNA的分離純化、RT-PCR和cDNA文庫構(gòu)建實(shí)驗(yàn)安排在連續(xù)的時(shí)間內(nèi)進(jìn)行。