細(xì)胞計(jì)數(shù)及活力測定方法

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一、原理
培養(yǎng)的細(xì)胞在一般條件下要求有一定的密度才能生長良好,所以要進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù).計(jì)數(shù)結(jié)果以每毫升細(xì)胞數(shù)表示.細(xì)胞計(jì)數(shù)的原理和方法與血細(xì)胞計(jì)數(shù)相同.
在細(xì)胞群體中總有一些因各種原因而死亡的細(xì)胞,總細(xì)胞中活細(xì)胞所占的百分比叫做細(xì)胞活力,由組織中分離細(xì)胞一般也要檢查活力,以了解分離的過程對細(xì)胞是否有損傷作用.復(fù)蘇后的細(xì)胞也要檢查活力,了解凍存和復(fù)蘇的效果.
用臺盼蘭染細(xì)胞,死細(xì)胞著色,活細(xì)胞不著色,從而可以區(qū)分死細(xì)胞與活細(xì)胞.利用細(xì)胞內(nèi)某些酶與特定的試劑發(fā)生顯色反應(yīng),也可測定細(xì)胞相對數(shù)和相對活力.
二、儀器、用品與試劑
1、儀器與用品：普通顯微鏡、血球計(jì)數(shù)板、試管、吸管、酶標(biāo)儀（或分光光度計(jì)）
2、試劑：0.4％臺盼蘭,0.5％四甲基偶氮唑鹽（MTT）、酸化異丙醇
3、材料：細(xì)胞懸液
三、操作步驟
（一）細(xì)胞計(jì)數(shù)
1、將血球計(jì)數(shù)板及蓋片用擦試干凈,并將蓋片蓋在計(jì)數(shù)板上.
2、將細(xì)胞懸液吸出少許,滴加在蓋片邊緣,使懸液充滿蓋片和計(jì)數(shù)板之間.
3、靜置3分鐘.
4、鏡下觀察,計(jì)算計(jì)數(shù)板四大格細(xì)胞總數(shù),壓線細(xì)胞只計(jì)左側(cè)和上方的.然后按下式計(jì)算：
細(xì)胞數(shù)/ml＝4大格細(xì)胞總數(shù)/ 4×10000
注意：鏡下偶見由兩個(gè)以上細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán),應(yīng)按單個(gè)細(xì)胞計(jì)算,若細(xì)胞團(tuán)占10%以上,說明分散不好,需重新制備細(xì)胞懸液.
（二）細(xì)胞活力
1、將細(xì)胞懸液以0.5ml加入試管中.
2、加入0.5ml 0.4%臺盼蘭染液,染色2一3分鐘.
3、吸取少許懸液涂于載玻片上,加上蓋片.
4、鏡下取幾個(gè)任意視野分別計(jì)死細(xì)胞和活細(xì)胞數(shù),計(jì)細(xì)胞活力.
死細(xì)胞能被臺盼蘭染上色,鏡下可見深蘭色的細(xì)胞,活細(xì)胞不被染色,鏡下呈無色透明狀.
活力測定可以和細(xì)胞計(jì)數(shù)合起來進(jìn)行,但要考慮到染液對原細(xì)胞懸液的加倍稀釋作用.
（三）MTT法測細(xì)胞相對數(shù)和相對活力
活細(xì)胞中的琥珀酸脫氫酶可使MTT分解產(chǎn)生蘭色結(jié)晶狀甲贊顆粒積于細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞周圍.其量與細(xì)胞數(shù)呈正比,也與細(xì)胞活力呈正比.
l、細(xì)胞懸液以1000rpm離心10分鐘,棄上清液.
2、沉淀加入0.5－1ml MTT,吹打成懸液.
3、37℃下保溫2小時(shí).
4、加入4—5 ml酸化異丙醇（定容）.打勻.
5、1000 rpm離心,取上清液酶標(biāo)儀或分光光度計(jì)570nm比色,酸化異丙醇調(diào)零點(diǎn).
注意：MTT法只能測定細(xì)胞相對數(shù)和相對活力,不能測定細(xì)胞數(shù).
附：1、0.4%臺盼蘭染液配制：
臺盼蘭 0.4克加雙蒸水至100 ml.
2、MTT配制：
MTT 0.5克,溶于100 ml的磷酸緩沖液或無酚紅的基礎(chǔ)液中.4℃下保存.
3、酸化異丙醇配制：
異丙醇中加入HCl使zui終達(dá)0.04mol/L.

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