小鼠二?；视?/span>（DAG/DG）ELISA試劑盒說明書

預(yù)期應(yīng)用

ELISA法定量測定小鼠血清、血漿、組織勻漿或其它相關(guān)生物液體中DAG含量。

實驗原理

用純化的DAG抗體包被微孔板，制成固相載體，往微孔中依次加入標(biāo)本或標(biāo)準(zhǔn)品、生物素化的DAG抗體、HRP標(biāo)記的親和素，經(jīng)過*洗滌后用底物（TMB）顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的DAG呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（ 值），計算樣品濃度。

試劑盒組成及試劑配制

1、 酶標(biāo)板：一塊（96孔）

2、 標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）： 2瓶，請臨用前15分鐘內(nèi)配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至1ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時反復(fù)顛倒/搓動以助溶解，其濃度為400 ng/ml，將其稀釋為40 ng/ml后，再做系列倍比稀釋（注：不要直接在板中進(jìn)行倍比稀釋），分別配制成40 ng/ml，20 ng/ml，10 ng/ml，5 ng/ml，2.5 ng/ml，1.25 ng/ml，0.625 ng/ml，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 ng/ml。如配制20 ng/ml標(biāo)準(zhǔn)品：取0.5ml （不要少于0.5ml ）40 ng/ml的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。

3、 樣品稀釋液：1×20ml。

4、 檢測稀釋液A：1×10ml。

5、 檢測稀釋液B：1×10ml。

6、 檢測溶液A：1×120 /瓶（1:100）。臨用前以檢測稀釋液A 1:100稀釋（如：10 檢測溶液A / 990 檢測稀釋液A），充分混勻，稀釋前根據(jù)預(yù)先計算好的每次實驗所需的總量配制（100 /孔），實際配制時應(yīng)多配制  0.1-0.2ml。

7、 檢測溶液B：1×120 /瓶（1:100）。臨用前以檢測稀釋液B 1:100稀釋。稀釋方法同檢測溶液A。

8、 底物溶液：1×10ml/瓶。

9、 濃洗滌液：1×30ml/瓶，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍。

10、終止液：1×10ml/瓶（2 mol/L H₂SO₄）。

11、覆膜：5張

12、使用說明書：1份

自備物品

1、 酶標(biāo)儀（建議儀器使用前提前預(yù)熱）

2、 微量加液器及吸頭，EP管

3、 蒸餾水或去離子水，濾紙

標(biāo)本的采集及保存

1、 血清：全血標(biāo)本請于室溫放置2小時或4 過夜后于1000 g離心20分鐘，取上清即可檢測，或?qū)⑸锨逯糜?/span>-20 或-80 保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

2、 血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于 1000 g離心15分鐘，取上清即可檢測，或?qū)⑸锨?/span>置于-20 或-80 保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

3、  組織勻漿：將動物的組織標(biāo)本先用PBS洗滌，去除多余血液，勻漿化后放在5~10 ml PBS中于-20℃放置過夜，第二天，經(jīng)過二次反復(fù)凍融破膜，將勻漿物5000x g離心5分鐘，取上清即可檢測。

4、 其它生物標(biāo)本：請1000 g離心20分鐘，取上清即可檢測，或?qū)⑸锨逯糜?/span>-20 或-80 保    存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

注：以上標(biāo)本均應(yīng)密封保存，4 保存應(yīng)小于1周，-20 不應(yīng)超過1個月，-80 不應(yīng)超過2個月；標(biāo)本溶血會影響zui后檢測結(jié)果，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項檢測。

操作步驟

實驗開始前，各試劑均應(yīng)平衡至室溫，試劑不能直接在37 溶解；試劑或樣品配制時，均需充分混勻，混勻時盡量避免起泡。實驗前應(yīng)預(yù)測樣品含量，如樣品濃度過高時，應(yīng)對樣品進(jìn)行稀釋，以使稀釋后的樣品符合試劑盒的檢測范圍，計算時再乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。

1、 加樣：分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔。空白孔加樣品稀釋液 100 ，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品100 ，注意不要有氣泡，加樣時將樣品加于酶標(biāo)板底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜，37 溫育2小時。為保證實驗結(jié)果有效

性，每次實驗請使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2、 棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加檢測溶液A工作液 100 （臨用前配制），酶標(biāo)板加上覆膜，37 溫育1小時。

3、 棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板 3次，每次浸泡1-2分鐘，大約400 /每孔，甩干（也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干）。

4、 每孔加檢測溶液B工作液（臨用前配制）100 ，加上覆膜，37 溫育1小時。

5、 棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次，方法同步驟3。

6、 每孔加底物溶液90 ，酶標(biāo)板加上覆膜37 避光顯色（反應(yīng)時間控制在15-30分鐘，當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)孔的前3-4孔有明顯的梯度藍(lán)色，后3-4孔梯度不明顯時，即可終止）。

7、 每孔加終止溶液50 ，終止反應(yīng)，此時藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物    液的加入順序相同。

8、 立即用酶標(biāo)儀在450nm波長測量各孔的光密度（ 值）。

注：

1、 試劑準(zhǔn)備：所有試劑在使用前應(yīng)平衡至室溫，使用后請立即按照說明書要求保存試劑。實驗操作中請使用一次性的吸頭，避免交叉污染。

2、 加樣：加樣或加試劑時，*個孔與zui后一個孔加樣之間的時間間隔如果太大，將會導(dǎo)致不同的 “預(yù)溫育”時間，從而明顯地影響到測量值的準(zhǔn)確性及重復(fù)性。一次加樣時間（包括標(biāo)準(zhǔn)品及所有樣品）控制在10分鐘內(nèi)。推薦設(shè)置復(fù)孔進(jìn)行實驗。

3、 溫育：為防止樣品蒸發(fā)，實驗時將加上蓋或覆膜的酶標(biāo)板置于濕盒內(nèi)，以避免液體蒸發(fā)；洗板后應(yīng)盡快進(jìn)行下步操作，任何時侯都應(yīng)避免酶標(biāo)板處于干燥狀態(tài)；同時應(yīng)嚴(yán)格遵守給定的溫育時間和溫度。

4、 洗滌：洗滌過程中反應(yīng)孔中殘留的洗滌液應(yīng)在濾紙上拍干，勿將濾紙直接放入反應(yīng)孔中吸水，同時要消除板底殘留的液體和手指印，避免影響zui后的酶標(biāo)儀讀數(shù)。

5、 試劑配制：Detection A及Detection B在使用前請手甩幾下或少時離心處理，以使管壁或瓶蓋的液體沉積到管底。標(biāo)準(zhǔn)品、檢測溶液A工作液、檢測溶液B工作液請依據(jù)所需的量配制使用，并使用相應(yīng)的稀釋液配制，不能混淆。請配制標(biāo)準(zhǔn)品及工作液，盡量不要微量配制（如吸取檢測溶液A時，一次不要小于10 ），以避免由于不準(zhǔn)確稀  釋而造成濃度誤差；請勿重復(fù)使用已稀釋過的標(biāo)準(zhǔn)品、檢測溶液A工作液、檢測溶液B工作液。

6、 反應(yīng)時間的控制：加入底物后請定時觀察反應(yīng)孔的顏色變化（比如，每隔10分鐘），如顏色較深，請?zhí)崆凹尤虢K止液終止反應(yīng)，避免反應(yīng)過強(qiáng)從而影響酶標(biāo)儀光密度讀數(shù)。

7、 底物：底物請避光保存，在儲存和溫育時避免強(qiáng)光直接照射。

洗板方法

1、 手工洗板方法：將推薦的洗滌緩沖液至少0.4ml注入孔內(nèi)，浸泡1-2分鐘，吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體，在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次；根據(jù)需要，重復(fù)此過程數(shù)次。

2、 自動洗板：如果有自動洗板機(jī)，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實驗過程中。

特異性

    本試劑盒可同時檢測重組或天然的小鼠DAG，且與其它相關(guān)蛋白無交叉反應(yīng)。

計算

  各標(biāo)準(zhǔn)品及樣本 值扣除空白孔 值后作圖（七點圖），如設(shè)置復(fù)孔，則 應(yīng)取其平均值計算。以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為縱坐標(biāo)（對數(shù)坐標(biāo)），值為橫坐標(biāo)（對數(shù)坐標(biāo)），在對數(shù)坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。推薦使用專業(yè)制作曲線軟件進(jìn)行分析，如 curve expert 1.3，根據(jù)樣品值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度，乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與 值計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程式，將樣品的 值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。

檢測范圍：0.625 ng/ml - 40 ng/ml，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線請取用以下濃度值： 40 ng/ml，20 ng/ml，10 ng/ml，5 ng/ml，2.5 ng/ml，1.25 ng/ml，0.625 ng/ml。

zui低檢測限：0.156 ng/ml

說明

1、  由于現(xiàn)有條件及科學(xué)技術(shù)水平尚不能對所有供貨商提供的所有原料進(jìn)行全面的鑒定與分析，

    本產(chǎn)品可能存在一定的質(zhì)量技術(shù)風(fēng)險。

2、  zui終的實驗結(jié)果與試劑的有效性、實驗者的相關(guān)操作以及當(dāng)時的實驗環(huán)境密切相關(guān)，請務(wù)必

準(zhǔn)備充足的標(biāo)本備份。

3、 在儲存及溫育過程中避免將試劑暴露在強(qiáng)光中。所有試劑瓶蓋須蓋緊以防止蒸發(fā)和微生物的   污染，因為蛋白水解酶的干擾將導(dǎo)致出現(xiàn)錯誤的結(jié)果。

4、 試劑盒保存：請收到試劑盒后盡快將標(biāo)準(zhǔn)品、檢測溶液A和檢測溶液B保存于-20 ，其余試劑短期保存請置于4 ，長期保存則置于-20 。開封后的酶標(biāo)板要密封加干燥劑后保存于-20 ，避免潮濕。

5、 濃洗滌液會有鹽析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶。

6、 剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會有少許水樣物質(zhì)，此為正?，F(xiàn)象，不會對實驗結(jié)果造成任何影響。

7、 有效期：6個月。

8、 本操作說明適用于48T試劑盒，但48T試劑盒所有試劑減半。