小麥萌發(fā)前后淀粉酶活力的測定

一、目的

學習和掌握測定淀粉酶（包括α-淀粉酶和β-淀粉酶）活力的原理和方法。

二、原理

淀粉是植物zui主要的貯藏多糖，也是人和動物的重要食物和發(fā)酵工業(yè)的基本原料。淀粉經淀粉酶作用后葡萄糖、麥芽糖等小分子物質而被機體利用。淀粉酶主要包括α-淀粉酶和β-淀粉酶兩種。α-淀粉酶可隨機地作用于淀粉中的α-1,4-糖苷鍵，葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、糊精等還原糖，同時使淀粉的粘度降低，因此又稱為液化酶。β-淀粉酶可從淀粉的非還原性末端進行水解，每次水解下一分子麥芽糖，又被稱為糖化酶。淀粉酶催化產生的這些還原糖能使3,5-二硝基水楊酸還原，棕紅色的3-氨基-5-硝基水楊酸，淀粉酶活力越高,這種棕紅色越深，其反應如下：

淀粉酶活力的大小與產生的還原糖的量成正比。用標準濃度的麥芽糖溶液制作標準曲線，用比色法測定淀粉酶作用于淀粉后的還原糖的量，以單位重量樣品在一定時間內的麥芽糖的量表示酶活力。

淀粉酶存在于幾乎所有植物中。萌發(fā)3-4天的小麥種子，淀粉酶活力zui強，其中主要是α-淀粉酶和β-淀粉酶。兩種淀粉酶特性不同，α-淀粉酶不耐酸，在pH3.6以下迅速鈍化。β-淀粉酶不耐熱，在70℃15min鈍化。根據(jù)它們的這種特性，在測定活力時鈍化其中之一，就可測出另一種淀粉酶的活力。本實驗采用加熱的方法鈍化β-淀粉酶，測出α-淀粉酶的活力。在非鈍化條件下測定淀粉酶總活力（α-淀粉酶活力+β-淀粉酶活力），再減去α-淀粉酶的活力，就可求出β-淀粉酶的活力。

操作步驟

1．淀粉酶液的制備

稱取1g 25℃下萌發(fā)3天的小麥種子（芽長約1-1.5cm），置于研缽中，加入少量石英砂和2mL蒸餾水，研磨成勻漿后，將勻漿轉入離心管中，用6mL蒸餾水分次將殘渣洗入離心管。提取液在室溫下放置提取15～20min，每隔２分鐘攪動1次，使其充分提取。然后在3 000r/min轉速下離心10min，將上清液倒入50mL容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，搖勻，即為淀粉酶原液，用于淀粉酶活力的測定。吸取上述淀粉酶原液10mL，放入50mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，搖勻，即為淀粉酶稀釋液，用于淀粉酶總活力的測定。

取干燥種子或浸泡2.5小時后的小麥種子１g，進行淀粉酶的提取，提取方法同上。

2.麥芽糖標準曲線制作：取7支干凈的具塞刻度試管，編號，按表1加入試劑。

附 注

（1）樣品提取液的定容體積和酶液稀釋倍數(shù)可根據(jù)不同材料酶活性的大小而定。

（2）為了確保酶促反應時間的準確性，在進行保溫這一步驟時，可以將各試管每隔一定時間依次放入恒溫水浴，準確記錄時間，到達5min時取出試管，立即加入3,5-二硝基水楊酸以終止酶反應，以便盡量減小因各試管保溫時間不同而引起的誤差。同時恒溫水浴溫度變化應不超過±0.5℃。

（3）如果條件允許，各實驗小組可采用不同材料，例如萌發(fā)1d、2d、3d、4d的小麥種子，比較測定結果，以了解萌發(fā)過程中這兩種淀粉酶活性的變化。