諾氟沙星 ELISA 試劑盒研制與性能鑒定

諾氟沙星（norfloxacin, Nor）是第三代喹諾酮類藥物，對(duì)革蘭氏陽(yáng)、陰性菌，一些支原體，衣原體，分枝桿菌屬均具有活性[1-2]。由于殺菌效 果好，價(jià)格低廉，而廣泛應(yīng)用于動(dòng)物飼料、飲水及動(dòng)物疫病治療中[3]。在動(dòng)物體組織中形成殘留并通過食 物鏈危害人體健康[4-5]。因此，必須建立快速、有效、 簡(jiǎn)便的諾氟沙星監(jiān)測(cè)方法，嚴(yán)格監(jiān)控諾氟沙星的使用， 以保證食品安全，維護(hù)消費(fèi)者身體健康。【前人研究 進(jìn)展】為了準(zhǔn)確用藥，降低超量使用對(duì)人及動(dòng)物的危 害，科研工作者先后建立多種諾氟沙星檢測(cè)方法。包 括液相色譜及衍生法[6-8]，簡(jiǎn)單色譜法[9]，毛細(xì)管電泳 及化學(xué)發(fā)光法[10-11]，新型光學(xué)探針法[12]，電化學(xué)傳感 器法[13]，一階導(dǎo)數(shù)同步熒光光譜法[14]，質(zhì)譜結(jié)合量子 計(jì)算法[15]。上述方法檢測(cè)結(jié)果比較，但需要比較 昂貴的檢測(cè)儀器，而且對(duì)儀器操作人員有相應(yīng)的技術(shù) 要求；樣品制備要求比較復(fù)雜，測(cè)定步驟繁瑣耗時(shí)， 檢測(cè)一個(gè)樣品需要耗費(fèi)一天甚至更長(zhǎng)的時(shí)間。酶聯(lián)免 疫吸附實(shí)驗(yàn)是根據(jù)抗原抗體特異結(jié)合反應(yīng)原理結(jié)合酶 標(biāo)記技術(shù)建立的檢測(cè)方法，檢測(cè)步驟相對(duì)比較簡(jiǎn)單， 已有報(bào)道應(yīng)用間接競(jìng)爭(zhēng) ELISA 法檢測(cè)水體中諾氟沙 星殘留[16]，但在該研究中使用的是多克隆抗體，而研 究認(rèn)為多克隆抗體特異性不強(qiáng)，交叉反應(yīng)比較多，難 以標(biāo)準(zhǔn)化?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】以單克隆抗體為基礎(chǔ)的 ELISA 檢測(cè)技術(shù)靈敏、特異，是藥殘、農(nóng)殘及毒素污 染監(jiān)測(cè)技術(shù)的發(fā)展方向，但是目前還鮮見利用諾氟沙 星單克隆抗體建立 ELISA 檢測(cè)試劑盒的報(bào)道?！緮M解 決的關(guān)鍵問題】本研究以實(shí)驗(yàn)室所制備的諾氟沙星單 克隆抗體為基礎(chǔ)，通過確定*抗體及二抗工作濃度， 研發(fā)諾氟沙星 ELISA 檢測(cè)試劑盒，同時(shí)對(duì)試劑盒的各 種性能進(jìn)行鑒定評(píng)價(jià)，為鮮奶中諾氟沙星殘留檢測(cè)提 供簡(jiǎn)便有效的技術(shù)手段。諾氟沙星是氟喹諾酮類藥物的一種，其抗菌譜比 較寬且價(jià)格低廉，因此被廣泛應(yīng)用在畜牧行業(yè)中。而 其超量使用會(huì)在動(dòng)物組織中殘留，通過食物鏈危害人 類健康[21]，建立諾氟沙星免疫學(xué)快速檢測(cè)技術(shù)對(duì)監(jiān)控 諾氟沙星濫用，降低食品安全事件發(fā)生意義重大。

           諾氟沙星 ELISA 試劑盒的制備

ELISA 技術(shù)是目前應(yīng)用zui為普遍的免疫分析方法，其具有靈敏性好，特異性強(qiáng)，便于操作等優(yōu)點(diǎn)，因此得以在食品安全監(jiān)控領(lǐng)域廣泛應(yīng)用[22]。本文所研 制的 Nor 試劑盒采用非均相間接競(jìng)爭(zhēng) ELISA 模式，將 包被原 Nor-OVA 包被在聚乙烯酶標(biāo)板中，并利用蛋 白封閉液，封閉酶標(biāo)板剩余的結(jié)合位點(diǎn)。進(jìn)行樣品檢 測(cè)時(shí)，加入含諾氟沙星的樣品或諾氟沙星標(biāo)準(zhǔn)品，同 時(shí)加入特定工作濃度的諾氟沙星單克隆抗體，這樣形 成一個(gè)競(jìng)爭(zhēng)體系，即酶標(biāo)板上包被的 Nor 和加入到酶 標(biāo)板中的游離 Nor，二者共同競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合加入的 Nor 單抗上有限的抗原結(jié)合位點(diǎn)，反應(yīng)一定時(shí)間后，利用洗脫液把沒有與酶標(biāo)板上包被原結(jié)合的單抗及游離 Nor 清洗掉。加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗與吸附在酶 標(biāo)板上的 Nor 單抗結(jié)合，洗脫多余的酶標(biāo)記二抗，然 后加入酶的顯色底物，以此顯示樣品中 Nor 與單抗結(jié) 合情況。通過建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以計(jì)算樣品中 Nor 濃 度。本研究中利用自備的 Nor 單抗，采用方陣法確定 了單抗及酶標(biāo)二抗工作濃度，從而建立了諾氟沙星間 接競(jìng)爭(zhēng) ELISA 試劑盒。

       諾氟沙星 ELISA 試劑盒的性能鑒定

ELISA 試劑盒性能是否良好，主要是通過以下幾 個(gè)方面來鑒定，包括其靈敏性，檢測(cè)限，特異性，準(zhǔn) 確性，精密性，保質(zhì)期等。同時(shí)還需要用目前的國(guó)標(biāo) 方法來確證其性能[20]。本研究中制備的試劑盒檢測(cè)限 為 1.00 μg·L-1，中國(guó)還沒有規(guī)定奶中諾氟沙星殘留zui 高*，而對(duì)同系物恩諾沙星*為 100 μg·L-1，達(dá)氟 沙星的*為 30 μg·L-1[23-24]，說明研制的諾氟沙星試 劑盒的檢測(cè)*可以滿足日常的檢測(cè)要求。另外本研 究所制備的試劑盒和其他的氟喹諾酮同系物藥物有一 定的交叉反應(yīng)性，容易出現(xiàn)樣品的假陽(yáng)性結(jié)果。但是， 也正是由于這種交叉反應(yīng)性，使得本研究制備試劑盒 既可以監(jiān)控諾氟沙星殘留，也可以監(jiān)控其同系物藥物 殘留。本研究制備的試劑盒添加回收率比較高，變異系 數(shù)比較低；而且不同批次的試劑盒的添加回收率均比 較高，批內(nèi)批間的變異系數(shù)均比較低。而一般認(rèn)為， 試劑盒的樣品添加回收率比較高，變異系數(shù)小于 15% 時(shí)就說明試劑盒的準(zhǔn)確度及精密度比較高[20, 25]。

   中國(guó)的 GB/T 21312-2007 中明確規(guī)定，諾氟沙星 檢測(cè)仲裁方法之一是 LC-MS/MS 法。用制備的諾氟沙 星 試劑盒 檢測(cè)各 種濃度的 諾氟沙 星樣品 時(shí)， 與 LC-MS/MS 進(jìn)行檢測(cè)結(jié)果一致，二者無顯著差異，說 明本研究制備的試劑盒測(cè)定結(jié)果比較準(zhǔn)確，性能可靠。 而用兩者檢測(cè)實(shí)際生產(chǎn)當(dāng)中的未知樣品時(shí)，二者結(jié)果 也*一致。當(dāng)檢測(cè)陰性樣品時(shí)，二者均為未檢出； 而檢測(cè)陽(yáng)性樣品時(shí)，二者之間的檢測(cè)結(jié)果差異不顯著， 進(jìn)一步說明所制備的試劑盒性能準(zhǔn)確可靠。

                                   結(jié)論

本研究制備出靈敏、特異、準(zhǔn)確，操作快速簡(jiǎn) 便的諾氟沙星間接競(jìng)爭(zhēng) ELISA 試劑盒。該試劑盒可 以同時(shí)監(jiān)控氟喹諾酮類多個(gè)同系藥物在奶中的殘 留。試劑盒的開發(fā)有助于加強(qiáng)對(duì)該類獸藥檢測(cè)監(jiān)控，為提高奶類產(chǎn)品安全，保護(hù)消費(fèi)者身體健康提供技術(shù)支撐。