本期新聞中心應(yīng)客戶要求，讓大家一起來圍觀解答新手做實驗遇到的問題解答：

以下由客戶自訴：

1.采用的是ELISA雙抗體夾心法測定尿液標(biāo)本中人腎損傷分子-1（Kim-1）水平。某一國產(chǎn)96孔ELISA試劑盒（本次實驗只用了48孔，猜想應(yīng)該不是試劑盒的原因，因為好幾個師姐用的都是這家的試劑盒，結(jié)果還可以，能做出標(biāo)準(zhǔn)曲線，且復(fù)孔間差異并不大）。

2.一次加樣時間：說明書上要求一次加樣時間控制在5分鐘內(nèi)，而我的一次加樣時間基本在10min以上。

實驗前準(zhǔn)備：

1.尿液樣本的收集與保存：-80℃冰箱保存尿液標(biāo)本1年左右，1周前在冰中融化分裝，3000轉(zhuǎn)離心30min取上清液（因離心管與離心機不匹配，故將尿液從原離心管吸至相匹配的離心管中，原離心管下邊有尿沉渣，吸的時候未打勻而是直接吸的，不知道是否對結(jié)果有影響？），需要用的放在4度冰箱（做實驗用的標(biāo)本也就是放在4度冰箱約1周的標(biāo)本），暫時不需要用的放在-20度冰箱。

2.試劑盒從4度冰箱取出，將需要用的試劑及板拿出來放在實驗臺平衡45min。

3.尿液實驗前未做稀釋處理。

操作步驟：

1.標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋與加樣：按照說明書，我采用的垂直加樣，只是加樣速度慢，盡量加至底部，不觸壁，不產(chǎn)生氣泡。

2.溫育說明書上要求30min，而我的大概是35min，是在培養(yǎng)箱中進(jìn)行的。

3.洗滌：也是加樣速度慢，全部加樣后停了1min，甩干（甩到甩不出液體為止），然后在濾紙上拍干（拍到?jīng)]有液體流出為止），就這樣重復(fù)了5次。

4.顯色：剛開始培養(yǎng)箱溫度沒升至37度，我也先放里邊了，是等升至37度后開始計時的。

疑問：

1.為什么標(biāo)準(zhǔn)孔的濃度會出現(xiàn)如上圖的結(jié)果？

2.為什么復(fù)孔間的差異這么這么的大？

實驗中沒有少加或加錯樣，懇請各位戰(zhàn)友幫忙找原因，不勝感激！

1.為什么標(biāo)準(zhǔn)孔的濃度會出現(xiàn)如上圖的結(jié)果？  你標(biāo)準(zhǔn)品也就120-80ng/L有些線性，可使后邊的40-10ng/L OD值又再次突然高上去了，且40-10ng/L的OD值復(fù)孔間偏差還算不大。我覺得你先從稀釋的角度看看吧，說明書提供的稀釋方法太麻煩，可能會導(dǎo)致操作時出現(xiàn)問題，你不如在干凈的EP管中按照標(biāo)準(zhǔn)品的比例關(guān)系進(jìn)行稀釋，稀釋完后再統(tǒng)一加入酶標(biāo)板孔中。

2.為什么復(fù)孔間的差異這么這么的大？ 我覺得兩方面原因，你標(biāo)準(zhǔn)品復(fù)孔差異大，可能跟稀釋手法有關(guān)。你的樣本OD值3復(fù)孔間有時會出現(xiàn)偏差較大的情況 可能跟洗板有關(guān)系，用洗板機洗板洗，可能與你尿樣未混勻也有關(guān)（雖然可能性很?。?。但是我覺得和你說的：“故將尿液從原離心管吸至相匹配的離心管中，原離心管下邊有尿沉渣，吸的時候未打勻而是直接吸的”沒有什么關(guān)系，畢竟你已經(jīng)離心取上清了。

至于加樣時間5min還是10min，溫預(yù)30min，還是35min等等操作上與說明書略有差異的地方都不是出現(xiàn)你這種結(jié)果的直接原因，畢竟雙抗體夾心法的試劑盒對操作和時間沒有競爭法那么嚴(yán)格。

說句實話我看到這個試劑盒的說明書時我*驚呆了，首先看標(biāo)準(zhǔn)曲線：

上圖是勁馬公司人TIM-1/KIM-1的ELISA說明書提供的數(shù)據(jù),RND的線性范圍有70倍左右，而你的試劑盒只有12倍，一般的雙抗體夾心法線性范圍都不會只有10倍左右；在看定量的試劑盒至少要有一個0點吧畢竟它代表了試劑盒包被抗體和酶標(biāo)抗體的交叉反應(yīng)情況（也就是試劑盒的背景），樣本定值時至少要減去0點在定量吧，可使你的試劑盒只有一個空白孔（不加酶標(biāo)試劑）只能算作顯色液的背景。根本不能代表你試劑盒本身的背景情況。不知道你方不方便告知是什么牌子的試劑盒??zui后我想說一點：“猜想應(yīng)該不是試劑盒的原因，因為好幾個師姐用的都是這家的試劑盒，結(jié)果還可以，能做出標(biāo)準(zhǔn)曲線，且復(fù)孔間差異并不大”這并不能*排除試劑盒的問題，畢竟你師姐的項目是否和你一樣？？就算一樣批號一樣嗎？

上海勁馬實驗設(shè)備有限公司長期供應(yīng)酶免Elisa試劑盒、ELISA檢測試劑盒、免疫組化試劑盒、人Elisa試劑盒、大小鼠Elisa試劑盒、抗體抗原、各種系列ELISA檢測試劑盒，僅適用于科研，不適用于臨床診斷。公司提供免費代測，更好的為您服務(wù)。咨詢。