兔子腫瘤壞死因子αELISA試劑盒實驗原理：

本試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本中兔腫瘤壞死因子α（TNF-α）水平。用純化的兔腫

瘤壞死因子α（TNF-α）抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入腫

瘤壞死因子α，再與 HRP 標記的羊抗兔抗體結合，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，經(jīng)過徹

底洗滌后加底物 TMB 顯色。TMB 在 HRP 酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成

zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的兔腫瘤壞死因子α呈正相關。用酶標儀在 450nm 波長下

測定吸光度（OD 值），通過標準曲線計算樣品中兔腫瘤壞死因子α（TNF-α）濃度。

兔子腫瘤壞死因子αELISA試劑盒操作步驟：

1. 標準品的稀釋與加樣：在酶標包被板上設標準品孔 10孔，在*、第二孔中分別加標

準品 100μl，然后在*、第二孔中加標準品稀釋液 50μl，混勻；然后從*孔、第二

孔中各取 100μl 分別加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分別加標準品稀釋液 50μl，

混勻；然后在第三孔和第四孔中先各取 50μl 棄掉，再各取 50μl 分別加到第五、第六孔

中，再在第五、第六孔中分別加標準品稀釋液 50ul，混勻；混勻后從第五、第六孔中各

取 50μl 分別加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分別加標準品稀釋液 50μl，混

勻后從第七、第八孔中分別取 50μl 加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分別加標準

品稀釋液 50μl，混勻后從第九第十孔中各取 50μl 棄掉。（稀釋后各孔加樣量都為 50μl，

濃度分別為 15μg/L，10μg/L ，5μg/L，2.5μg/L，1.25μg/L）。

2. 加樣：分別設空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、待測樣

品孔。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液 40μl，然后再加待測樣品 10μl（樣

品zui終稀釋度為 5 倍）。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混

勻。

3. 溫育：用封板膜封板后置 37℃溫育 30分鐘。

4. 配液：將 20倍濃縮洗滌液用蒸餾水 20 倍稀釋后備用。

5. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置 30 秒后棄去，如此

重復 5 次，拍干。

6. 加酶：每孔加入酶標試劑 50μl，空白孔除外。

7. 溫育：操作同 3。

8. 洗滌：操作同 5。

9. 顯色：每孔先加入顯色劑 A50μl，再加入顯色劑 B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色

15分鐘.

10. 終止：每孔加終止液 50μl，終止反應（此時藍色立轉黃色）。

11. 測定：以空白空調零，450nm 波長依序測量各孔的吸光度（OD 值）。 測定應在加終止

液后 15分鐘以內進行。

兔子腫瘤壞死因子αELISA試劑盒注意事項：

1）在收集標本前都必須有一個完整的計劃，必須清楚要檢測的成份是否足夠穩(wěn)定。

2）我們提倡新鮮標本盡早檢測，對收集后及時進行檢測。說明：

樣品類型： 標本必須為液體，不含沉淀。包括血清、血漿、尿液、胸腹水、腦脊液、細胞培養(yǎng)上清、組織勻漿等。1ml的全血可得到0.5ml的血清 或血漿。每個標本量收集體積＝100ul×檢測種類。取材前須向銷售人員索要說明書。 

樣品采集： 收集標本前必須清楚要檢測的成份是否足夠穩(wěn)定。對收集后當天進行檢測的標本，儲存在4℃?zhèn)溆?，如有特殊原因需要周期收集標本?將標本及時分裝后放在-20℃或-70℃條件下保存。避免反復凍融。標本2-8℃可保存48小時，-20℃可保存1個月。-70度可保存6個月。部分激素類標本需添加抑肽酶。四、液體類標本：

包括血清、血漿、尿液、胸腹水、腦脊液、細胞培養(yǎng)上清等。

1）血清：

室溫血液自然凝固10-20分鐘后，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。

2）血漿：

應根據(jù)標本的要求選擇EDTA、檸檬酸鈉或肝素作為抗凝劑，混合10-20分鐘后，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。

3）尿液：

用無菌管收集。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。胸腹水、腦脊液參照此實行。

4）細胞培養(yǎng)上清：

A、檢測分泌性的成份時，用無菌管收集。離心20分鐘左右（2000-3000轉/ 分）。仔細收集上清。

B、檢測細胞內的成份時，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細胞懸液，細胞濃度達到100萬/ml左右。通過反復凍融，以使細胞破壞并 放出細胞內成份。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。

5）組織標本：

切割標本后，稱取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?。標本融化后仍然保?-8℃的溫度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或勻漿器將標本勻漿充分。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。分裝后一份待檢測，其余冷凍備用。